新藤黃酸誘導卵巢癌A2780細胞凋亡的作用研究

程 卉，李慶林，侯 梅，蘇婧婧

(安徽中醫藥大學科研實驗中心 新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，但卵巢上皮癌的病死率卻占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命及生存質量造成嚴重威脅[1-3]。化學治療是卵巢癌首選的治療方法之一，中藥及活性成分運用于抗腫瘤治療具有悠久的歷史，且中藥以其藥源廣泛，不良反應小，價格低廉，易于被患者接受等特點被用于化學治療的輔助治療。近年來，從中草藥中尋找天然抗腫瘤活性成分已經成為抗癌藥物研究的一個重要途徑和研究熱點。本實驗以中藥藤黃的主要成分之一——新藤黃酸作為研究藥物，探討其對卵巢癌細胞株A2780的增殖抑制作用及其可能的作用機制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 細胞培養箱：德國Memmert；生物安全柜(BSC-1600IIB2)：江蘇省蘇凈集團；高壓蒸汽滅菌鍋(GI-36)：福建省廈門致微儀器有限公司；全自動多功能酶標儀(Spectra-Max M2e)：美國MD公司；冷凍離心機：德國eppendorf；流式細胞儀(cytoflex)：美國Beckman cullter；倒置熒光顯微鏡(DMI-6000B)：德國徠卡公司。

1.2 試劑和藥品 新藤黃酸(純度>98%)：上海源葉生物有限公司；fluo-3AM：江蘇省碧云天生物有限公司；Hoechst 33342(貨號 B2261)：美國sigma公司；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法試劑盒：江蘇省南京凱基生物科技發展有限公司；Caspase-9(批號 16114)：美國Santa Cruz公司；細胞色素C(cytochrome C， Cyt C)(批號 AA43132)：美國Bioworld公司；p53蛋白(批號 GR194170-1)：英國Abcam公司。

2 方法

2.1 MTT檢測新藤黃酸對A2780細胞存活率的影響 消化對數生長期A2780，收集細胞，調整細胞密度至5×104/mL，接種至96孔板中，每組對應6個復孔，每組加入100 μL上述懸液。種板24 h后，每孔分別加入1、2、4、8、16、32 μmol/L的新藤黃酸溶液各100 μL，空白對照組加入相同容積的新鮮培養基。將細胞放在培養箱中分別培養24、48 h。待細胞結束培養前4 h，用移液器吸棄舊的培養基，向各孔中加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h，每孔加入DMSO 150 μL，緩慢震搖15 min，充分混合。570 nm波長下，使用多功能酶標儀檢測光密度(optical density，OD)，實驗至少重復3遍。按照下列公式計算細胞存活率：細胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%，然后以細胞存活率為縱軸，新藤黃酸濃度為橫軸，繪制細胞存活率曲線，計算IC50。

2.2 鈣離子水平檢測 將A2780細胞以每孔4×105接種于6孔培養板中，置于培養箱中培養過夜，次日向各孔中加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸，于培養箱中孵育24 h，用PBS輕柔洗滌細胞3次，加入1 μmol/L fluo-3AM染液至終濃度為0.05%，覆蓋細胞，置培養箱中孵育30 min，除去fluo-3AM染液， HBSS液洗滌細胞3次，加入HBSS液覆蓋細胞，37 ℃培養箱中孵育30 min，于倒置熒光顯微鏡下488 nm藍光激發拍照。

2.3 Hoechst 33342染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 胰酶消化收集的A2780細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養基調整細胞密度為6×104/mL，接種于6孔培養板中，每孔3 mL，于37 ℃ CO2培養箱中培養24 h。向各孔中加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸溶液，平行設空白對照組，于37 ℃ CO2培養箱中繼續培養24 h。預冷的PBS緩沖液輕柔沖洗細胞2次，向各孔中加入2 mL多聚甲醛固定液固定20 min，預冷的PBS緩沖液輕柔沖洗細胞2次，各孔中加入1 mL含Hoechst 33342(終濃度為20 μg/mL)的PBS緩沖液，37 ℃避光孵育10 min，棄去染液，PBS沖洗，各孔加入1 mL PBS后于倒置熒光顯微鏡下采用紫外激發觀察并拍照。

2.4 新藤黃酸對A2780細胞周期的影響 將A2780細胞以每孔8×105接種于50 mL培養瓶中，置于培養箱中培養過夜，次日向各瓶中加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸，于培養箱中孵育24 h，胰酶消化離心收集細胞，4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，棄去上清液。用-20 ℃預冷的70%乙醇點動離心混勻固定細胞，避光放置于4 ℃冰箱24 h后，離心棄去上清，用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，按說明書操作，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色10 min后，用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

2.5 新藤黃酸對A2780細胞凋亡率的影響 將卵巢癌細胞A2780細胞接種于50 mL培養瓶中，37 ℃培養箱中孵育過夜后，各瓶中分別加入2、4、8 μmol/L新藤黃酸，培養箱中孵育24 h，采用不含EDTA的消化液消化，1 000 r/min離心5 min并收集細胞，4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，棄去上清液，各組分別加入400 μL預冷的1×結合緩沖液，分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI溶液，混勻細胞，避光孵育15 min后，1 h內上機檢測。同時設陰性對照管和單標補償調節管，采用FC500流式細胞儀自帶功能軟件進行分析。

2.6 Western blot檢測新藤黃酸對A2780細胞凋亡相關蛋白表達的影響 各組細胞經胰酶消化收集后，用4 ℃預冷的PBS洗滌2次，再加入含PMSF的RIPA細胞裂解液(強)，置于冰上孵育10 min，12 000 r/min離心10 min收集上清于EP管中，加入上樣緩沖液后，100 ℃煮10 min，置于-20 ℃保存。蛋白定量后，每組上樣2.5 μg進行SDS-PAGE電泳分離，待電泳結束后濕轉到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入相應的一抗(兔抗，稀釋倍數均為1∶1 000)，置于搖床中4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，每次5 min，共3次；與對應的二抗(山羊抗兔1∶10 000)室溫下孵育1 h后，TBST洗膜，每次5 min，共3次?；瘜W發光顯色試劑盒顯色，置于凝膠成像儀上拍攝。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 MTT檢測新藤黃酸對A2780細胞存活率的影響 本研究采用濃度分別為1、2、4、8、16、32 μmol/L新藤黃酸處理卵巢癌A2780細胞24、48 h后，MTT檢測結果可見，與對照組相比，各給藥組細胞存活率隨著新藤黃酸濃度的增高而降低，且呈現明顯的量效和時效關系。實驗結果計算得出新藤黃酸作用A2780細胞24 h的IC50值為7.648 μmol/L，48 h的IC50值為6.426 μmol/L。見圖1。

圖1 新藤黃酸對A2780細胞存活率的影響

3.2 Fluo-3AM染色法觀察新藤黃酸對A2780細胞鈣離子水平的影響 Fluo-3AM染色熒光顯微鏡下觀察胞內鈣離子的水平，結果顯示：空白對照組在視野下呈現均一而暗淡的綠色熒光，而新藤黃酸2 μmol/L組與空白對照組相比綠色熒光強度增強，新藤黃酸4 μmol/L和8 μmol/L組細胞呈現明亮的綠色熒光，且具有明顯的濃度依賴性。見圖2。

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖2 Fluo-3AM染色法觀察新藤黃酸對A2780細胞鈣離子水平的影響(10×20倍)

3.3 Hoechst 33342檢測新藤黃酸對A2780細胞損傷的影響 Hoechst 33342染色倒置熒光顯微鏡下觀察發現，空白對照組細胞在鏡下呈現均一且暗淡的藍色熒光，而新藤黃酸2、4、8 μmol/L組隨著藥物濃度的增加，藍色熒光的強度逐漸增強，表明新藤黃酸可以誘導A2780細胞發生凋亡，且呈現一定的濃度依賴性。見圖3。

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖3 Hoechst 33342染色觀察新藤黃酸對A2780細胞損傷的影響(10×20倍)

3.4 流式細胞儀檢測新藤黃酸對A2780細胞周期的影響 與正常對照組相比，新藤黃酸2、4、8 μmol/L組均表現出G0/G1期阻滯，S期細胞比例顯著減少，且在2、4 μmol/L呈現一定的濃度依賴關系,以上結果表明新藤黃酸能誘導A2780細胞發生G0/G1期阻滯。見圖4。

3.5 流式細胞儀檢測新藤黃酸對A2780細胞凋亡率的影響 正常對照組細胞凋亡率在5%左右，細胞狀態良好，與正常對照組相比，新藤黃酸2、4、8 μmol/L組細胞凋亡率分別為(6.9±1.1)%、(13.4±3.7)%、(18.3±5.2)%，細胞凋亡率呈現濃度依賴性升高，結果表明新藤黃酸能誘導A2780細胞凋亡。見圖5。

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L 新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖4 流式細胞儀檢測新藤黃酸對A2780細胞周期的影響

注：A.空白對照組；B.2 μmol/L新藤黃酸組；C.4 μmol/L新藤黃酸組；D.8 μmol/L新藤黃酸組

圖5流式細胞儀檢測新藤黃酸對A2780細胞凋亡率的影響

3.6 Western blot檢測新藤黃酸對A2780細胞凋亡相關蛋白表達的影響 為了進一步研究新藤黃酸誘導A2780細胞凋亡的機制，實驗檢測不同濃度新藤黃酸作用細胞24 h后Cyt C、Caspase-9和p53蛋白的表達，實驗結果表明新藤黃酸作用A2780細胞后隨著藥物濃度的增加，Cyt C、Caspase-9和p53蛋白表達水平呈濃度依賴性升高。見圖6。

注：與0 μmol/L新藤黃酸組比較，*P<0.05

圖6新藤黃酸對A2780細胞內Cyt C、Caspase-9和p53蛋白表達的影響(Western blot法)

4 討論

藤黃是藤黃科植物藤黃的干燥樹脂，黃褐色且帶有蠟樣光澤，其具有攻毒蝕瘡、止血、殺蟲之功效，臨床用于頑癬濕瘡、無名腫毒、出血、燙傷以及腫瘤[4]。近年來，藤黃的主要成分新藤黃酸抗腫瘤活性日益受到科研工作者的關注，研究表明新藤黃酸對多種實體瘤細胞及白血病細胞均具有良好的抑制增殖作用，抗腫瘤活性強。本課題組多年研究結果表明，新藤黃酸作用多種腫瘤細胞株24 h的IC50為7.648 μmol/L,且對肺癌等裸鼠移植瘤具有良好的抑制腫瘤增長的效果[5-10]。本實驗采用MTT法檢測新藤黃酸對卵巢癌A2780細胞存活率的影響，結果表明在1～32 μmol/L范圍內新藤黃酸亦能有限降低A2780的存活率，且呈現明顯的濃度依賴關系，新藤黃酸作用24 h的IC50為7.648 μmol/L，表現出較強的體外抗腫瘤活性。

線粒體是真核細胞內ATP的產生場所，細胞維持生命活動所需能量的95%均由線粒體提供，其對維持細胞的正常功能起著至關重要的作用[11]。線粒體凋亡途徑是細胞凋亡的主要途徑之一，研究發現線粒體內包含一些與細胞凋亡密切相關的物質，如Cyt C、凋亡誘導因子、Ca2+和活性氧自由基[12-13]。研究表明，Cyt C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，各種凋亡刺激信號通過Bcl-2同源結構域3蛋白引起Bcl-2相關蛋白X(Bcl-2-associated protein X,Bax)移位到線粒體外膜并多聚化，形成膜通道，線粒體的膜電位下降，膜通透性增加，刺激線粒體釋放Cyt C和第二線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondrial-derived activator of caspase, Smac)，當Cyt C釋放到胞內以后，與凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)相互作用，在ATP和dATP的協助下形成凋亡復合體，凋亡復合體通過招募并激活Caspase-9，其進一步激活效應Caspase-3和Caspase-7，啟動Caspase級聯反應，切割細胞中多種底物，最終導致細胞凋亡[14-15]。

本實驗通過Annexin Ⅴ-FITC/PI試驗觀察新藤黃酸誘導A2780細胞凋亡的作用，實驗結果表明新藤黃酸可以誘導A2780細胞發生凋亡；且Fluo-3AM染色結果顯示，隨著新藤黃酸藥物濃度的增加，胞內Ca2+水平也逐漸升高；進一步通過Western blot實驗證實新藤黃酸作用細胞后線粒體凋亡相關蛋白Cyt C、p53和Caspase-9蛋白表達水平顯著增加；此外，PI單染色流式細胞儀檢測結果顯示，新藤黃酸能促使A2780細胞周期阻滯于G0/G1期，表明細胞增殖受到抑制。以上結果表明，新藤黃酸能誘導A2780細胞發生線粒體凋亡并且抑制細胞增殖，但其深入的信號轉導機制有待進一步的研究。