清腎顆粒對腎纖維化大鼠P-selectin/PSGL-1的干預作用

陳友雪 ，王億平，金 華，王 東，張 磊

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，安徽 合肥 230031)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一個重要的世界性健康問題，其病理基礎是腎纖維化。前期研究表明，CKD患者P-選擇素(P-selectin)水平表達異常，提示P-selectin與腎臟纖維化過程密切相關[1]。P-selectin的表達可能成為腎臟病變的標志，其與P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)的結合是啟動炎性反應和維持炎性狀態的一個關鍵因素[2-3]。本實驗擬觀察清腎顆粒是否能夠通過抑制P-selectin和PSGL-1的表達，從而達到抗5/6腎切除大鼠腎纖維化的作用。

1 材料

1.1 動物 選取72只雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，全部購自上海杰思捷實驗動物有限公司[生產許可證號：SCXK(滬)2013-0006]。

1.2 藥物與試劑 清腎顆粒由生大黃、白花蛇舌草、丹參、澤瀉等藥物組成。藥材由安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥房統一進貨，每袋顆粒劑10 g，皖藥制字BZ20080011。氯沙坦鉀由默沙東公司生產，每粒50 mg，國藥準字H20130409。CD62P/P-Selectin抗體、CD162/PSGL-1抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為AG09117573、AD110342。

2 方法

2.1 模型復制與分組 除正常組12只之外，其余60只大鼠均按文獻[4]方法復制5/6腎切除腎纖維化模型。將大鼠禁食12 h，麻醉，俯臥位固定于手術臺上，從距左脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上、下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1 min，復位腎臟，縫合。1周后切除整個右腎，2次共切除5/6腎臟。采用SPSS 17. 0 產生的隨機號隨機分為模型組，清腎顆粒高、中、低劑量組，氯沙坦組，每組12只。

2.2 給藥方法 各組動物均在模型復制后第1天開始灌胃，每日1次，每次2 mL。正常組、模型組分別采用等容量溫水灌胃；清腎顆粒低、中、高劑量組分別按每日4.0、8.0、16.0 g/kg(4.0 g/kg為成人臨床等效劑量)給予清腎顆粒水溶液灌胃；氯沙坦組給予氯沙坦鉀混懸液(每日13 mg/kg，近似臨床等效藥量)灌胃。連續給藥12周。

2.3 標本留取 將大鼠麻醉后仰臥位固定于手術臺上，取出左腎，并將取出的腎組織修剪掉纖維結締組織，用生理鹽水沖洗后，將腎組織迅速放入液氮，并置于-70 ℃冰箱中保存，用于提取P-selectin、PSGL-1蛋白及其RNA。

2.4 觀察指標 Western blot法檢測腎臟組織中P-selectin及PSGL-1的蛋白表達水平；RT-PCR法檢測腎臟組織中P-selectin、PSGL-1 mRNA表達水平。引物序列如下：

P-selectin:5′-CTGAGAACTGGGCAGAC-3′，5′-GGTAGCAGGAGCAGGTGTA-3′，220 bp。

PSGL-1: 5′-CTACCAAAAGAGGTCTGTTCATAC-3′，5′-TGTGCAGGGTGAGGTCATC-3′，395 bp。

3 結果

與正常組比較，模型組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA相對表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，清腎顆粒各劑量組和氯沙坦組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與氯沙坦組比較，清腎顆粒高劑量組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；清腎顆粒各組之間比較，清腎顆粒高劑量組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達水平最低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠腎臟組織中P-selectin和PSGL-1蛋白及其mRNA表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯沙坦組比較，△P<0.05；與清腎顆粒高劑量組比較，◇P<0.05

注：1.正常組；2.模型組；3.清腎顆粒高劑量組；4.清腎顆粒中劑量組；5.清腎顆粒低劑量組；6.氯沙坦組

圖1 Western blot法檢測各組大鼠P-selectin、PSGL-1表達水平

4 討論

腎纖維化是CKD的病理基礎，其過程是不可逆的，而最終發展結局是終末期腎臟病，因此如何延緩這一過程是亟待解決的關鍵問題。相關文獻表明，腎臟組織炎性病變在腎纖維化發生及進展中起到至關重要的作用[5]。腎單位毛細血管參與血漿濾過和再吸收、組織供氧和營養等重要環節，內皮細胞損傷推動慢性腎臟病發展的進程[6]。而P-selectin是炎癥、組織損傷時重要的黏附分子，可通過介導內皮細胞黏附、血小板與白細胞相互作用，參與炎性反應[7]。PSGL-1作為一種重要的炎性分子，主要表達于各種白細胞，是目前被發現的P-selectin中最主要的糖蛋白配體。PSGL-1的作用不但可以促進白細胞的黏附，而且還在激活白細胞的過程中作為信號分子傳遞信號[8]。內皮細胞上的P-selectin與白細胞上PSGL-1結合，可驅動白細胞在炎癥部位血管內皮表面滾動減緩，并通過反復黏附過程，促使白細胞遷移進入炎癥局部，參與腎臟纖維化過程的一系列炎性反應，而針對P-selectin及配體的抗黏附干預，可有效抑制纖維化形成及白細胞的炎性浸潤。

清腎顆粒為清熱化濕、祛瘀泄濁的中藥復方，其用于慢性腎衰竭濕熱證患者，療效顯著。前期實驗研究[9-12]表明，濕熱證是慢性腎衰竭患者的主要中醫證候，慢性腎衰竭濕熱證與腎臟炎癥狀態及高表達的炎性因子密切相關；具有清熱化濕祛瘀功效的中藥復方清腎顆粒能夠顯著降低慢性腎衰竭患者血漿P-selectin水平，發揮其保護腎功能、抗腎臟纖維化的作用。

本次研究結果表明，5/6腎切除大鼠腎組織中P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達水平明顯高于正常組(P<0.05)，經藥物干預后，各治療組大鼠P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達均顯著下降(P<0.05)，其中清腎顆粒高劑量組較氯沙坦組顯著降低(P<0.05)，清腎顆粒3個劑量組中，高劑量組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達水平最低(P<0.05)；結果提示清腎顆粒能夠降低P-selectin及其配體的蛋白和基因表達，其作用優于氯沙坦，且呈量效關系。清腎顆粒通過從基因轉錄和蛋白翻譯兩個方面下調腎組織P-selectin和PSGL-1的表達，從而發揮抗腎臟纖維化作用。