多劑量復(fù)方苦參注射液對吉西他濱在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的影響

張 盛，彭代銀，陳衛(wèi)東，孟子路，4，劉 李，5

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝研究所，安徽 合肥 230012;4.馬鞍山市人民醫(yī)院，安徽 馬鞍山 243000；5.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

肺癌是目前威脅人類健康的主要癌癥之一，其中大多數(shù)是非小細(xì)胞肺癌，其發(fā)病率為80%左右[1]，是臨床常見的一種惡性腫瘤疾病。由于該病早期缺少特異性的癥狀，大部分患者確診時已屬晚期，無法采用根治性手術(shù)進(jìn)行治療。因此，臨床上主要以減緩患者痛苦和延長患者生存期的化學(xué)治療方式進(jìn)行治療[2]。吉西他濱是細(xì)胞內(nèi)胞嘧啶的類似物，可以阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的合成，臨床上用于治療非小細(xì)胞肺癌，效果較佳，但是在化學(xué)治療過程中會出現(xiàn)一些不良反應(yīng)[3]。文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)，復(fù)方苦參注射液可保護(hù)并提高機體免疫力進(jìn)而提高化學(xué)治療療效[4]。而且，臨床上復(fù)方苦參注射液和吉西他濱注射液聯(lián)合使用后能減少患者不良反應(yīng)和提高藥物療效[5]。目前，關(guān)于復(fù)方苦參注射液和注射用鹽酸吉西他濱溶液聯(lián)用減毒增效作用的內(nèi)在原因尚未見報道。

在前期實驗[6]基礎(chǔ)上，本試驗旨在研究多劑量復(fù)方苦參注射液對注射用鹽酸吉西他濱在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的影響，以初步解釋臨床聯(lián)合使用復(fù)方苦參注射液和吉西他濱注射液治療疾病的減毒增效作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-001]供給，自由飲食，循環(huán)光照12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)至體質(zhì)量(200±20)g，隨后隨機分為對照組和復(fù)方苦參注射液低、中、高劑量組。

1.2 主要試藥和儀器 注射用鹽酸吉西他濱(批號 H20030104，每支0.2 g)：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；吉西他濱對照品(批號 100622-201202，純度≥98.0%)：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；復(fù)方苦參注射液(批號 20151131；5 mL×5支)：山西振東制藥股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-Fu，CAS號 51-21-8，純度≥99.0%)：阿拉丁工業(yè)公司(中國上海)；甲醇(色譜純)：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆粛u津LC-15C高效液相色譜儀：日本島津公司；氮吹濃縮儀(MTN-2800D)：拜泰齊貿(mào)易上海有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；LC-4016型低速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；XW-80A微型渦旋混合儀：上海滬西分析儀器有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AB135-S型十萬分之一電子天平：德國METTLER TOLEDO。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)條件 色譜柱：Wondasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(3.5∶96.5)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：268 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸吉西他濱標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)5-Fu標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，分別得到205 μg/mL鹽酸吉西他濱標(biāo)準(zhǔn)品溶液和215 μg/mL 5-Fu標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為對照品溶液，于4 ℃冰箱避光保存。

2.2.2 供試品溶液 根據(jù)注射用吉西他濱注射液說明書，取注射用吉西他濱粉末適量，用生理鹽水溶解并定量稀釋至每毫升約含吉西他濱2 mg的溶液，作為供試品溶液，用于大鼠尾靜脈注射，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 血漿樣品處理方法 將大鼠全血樣品250 μL置于肝素化離心管中，以3 000 r/min離心20 min后，取上清液100 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)物，再加入300 μL甲醇進(jìn)行蛋白沉淀，渦漩震蕩5 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清液，40 ℃氮氣吹干，加入100 μL超純水復(fù)溶，渦漩震蕩2 min，15 000 r/min離心10 min，取20 μL上清液，HPLC分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取不同濃度吉西他濱對照品溶液10 μL，分別加入空白血漿90 μL和濃度為22 μg/mL內(nèi)標(biāo)物10 μL，按濃度高低依次稀釋成濃度為200、150、75、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 μg/mL樣品，按照“2.3”項下方法處置，以血漿中待測物藥物濃度(X)及藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.017 4X-0.009 5(r=0.999)。結(jié)果表明，在0.781 25～200 μg/mL范圍內(nèi)，回歸方程呈良好的線性關(guān)系。

2.5 方法專屬性 取大鼠空白血漿樣品，含內(nèi)標(biāo)和吉西他濱的大鼠空白血漿樣品，尾靜脈注射鹽酸吉西他濱的大鼠血漿樣品后加內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項下條件處置，按“2.1”項色譜條件依次進(jìn)樣，見圖1。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾吉西他濱及內(nèi)標(biāo)5-Fu的檢測。

注：A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)+吉西他濱標(biāo)準(zhǔn)品；C.尾靜脈注射鹽酸吉西他濱后大鼠血漿+內(nèi)標(biāo)；1為5-Fu；2為吉西他濱

圖1 3種血漿樣品的HPLC圖

2.6 定量下限 按“2.3”項下方法處理配置成0.781 25 μg/mL的質(zhì)控樣品，按“2.1”項條件依次進(jìn)樣，以“2.4”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實際濃度，計算RSD為6.17%(n=5)。

2.7 精密度試驗

2.7.1 日間精密度 按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項下條件依次進(jìn)樣分析經(jīng)血漿樣品處理后的高濃度(150 μg/mL)、中濃度(12.5 μg/mL)、低濃度(1.562 5 μg/mL)、定量下限(0.781 25 μg/mL)4個濃度的質(zhì)控樣品，以“2.4”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實際濃度，得出RSD分別為8.62%、8.81%、5.0%、1.32%(n=5)。其準(zhǔn)確度分別為114.9%、96.0%、101.3%、104.7%(n=5)。

2.7.2 日內(nèi)精密度 按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項下條件依次進(jìn)樣分析，經(jīng)血漿樣品處理后的高、中、低、定量下限4個濃度的質(zhì)控樣品，以“2.4”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實際濃度，得出RSD分別為10.52%、8.56%、7.35%、6.25%(n=5)，其準(zhǔn)確度分別為101.9%、99.3%、95.6%、103.3%(n=5)。

2.8 提取回收率 按“2.3”項下方法操作，配置高、中、低3個濃度的血漿樣品，按“2.1”項下條件依次進(jìn)樣，記算吉西他濱與內(nèi)標(biāo)5-Fu峰面積比值(Ai)；配置3個相應(yīng)濃度的吉西他濱和內(nèi)標(biāo)5-Fu的混合對照品溶液，按“2.1”項下條件用HPLC依次進(jìn)樣，記算吉西他濱與內(nèi)標(biāo)5-Fu峰面積比值(A0)；按Ai/A0計算提取回收率，高、中、低3個濃度得提取回收率分別為95.05%、96.72.88%、98.26%(n=5)。

2.9 穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項依次進(jìn)樣分析經(jīng)血漿樣品處置后的高、低兩個濃度的質(zhì)控樣品，依次觀察血漿樣品在室溫12 h以及凍融3次的穩(wěn)定性。以“2.4”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實際濃度，將測得濃度與標(biāo)示濃度相比較，每一濃度的均值與標(biāo)示濃度的RSD分別為8.1%、9.3%(n=5)。觀察置于-20 ℃ 1周情況下的長期穩(wěn)定性，依次進(jìn)樣測定。每一濃度的均值與標(biāo)示濃度的RSD分別為6.0%、8.0%(n=5)。

2.10 藥物代謝動力學(xué)參數(shù) 取上述適應(yīng)性飼養(yǎng)的雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量為(200±20)g。隨機分為對照組和復(fù)方苦參注射液高、中、低3個劑量組，每組6只。對照組大鼠尾靜脈連續(xù)注射生理鹽水10 d，復(fù)方苦參各劑量組大鼠尾靜脈連續(xù)注射復(fù)方苦參注射液10 d，對照組和復(fù)方苦參注射液各劑量組于最后一天給藥后5 min，尾靜脈注射吉西他濱溶液(溶媒為生理鹽水)，吉西他濱給藥劑量為20 mg/kg，復(fù)方苦參注射液高、中、低劑量組給藥劑量分別為3.6、1.8、0.9 mL/kg，給藥前禁食不禁水12 h。于吉西他濱給藥后1、3、5、10、15、30、60、120、240、360、480、600、720 min從大鼠眼底靜脈叢取血，置于肝素化離心管，按“2.3”項下方法依次進(jìn)樣。對照組和復(fù)方苦參注射液低、中、高劑量組的藥時曲線見圖2；經(jīng)DAS 2.0分析后得出其對應(yīng)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，見表1。

使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 23.0，采用單因素方差分析和非參數(shù)檢驗Nemenyi法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，在多劑量復(fù)方苦參注射液對吉西他濱在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)影響中，與正常組比較，復(fù)方苦參注射液高劑量組AUC(0-t)和MRT(0-t)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明同時使用復(fù)方苦參注射液與吉西他濱注射液時，多劑量復(fù)方苦參注射液可以增加吉西他濱注射液的濃度，并延長其平均滯留時間。

圖2 多劑量復(fù)方苦參注射液對鹽酸吉西他濱在大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線的影響

組 別nt1/2α/mint1/2β/minCL/L/(min·kg)V/(L/kg)AUC(0-t)/[mg/(L·min)]MRT(0-t)/min對 照635.7±36.869.32±0.000.160±0.0400.001±0.00024 062.1±3 936.2260.7±53.7復(fù)方苦參低劑量669.3±0.069.32±0.000.187±0.0020.001±0.00027 805.6±8 513.1284.9±52.4復(fù)方苦參中劑量669.3±0.069.32±0.000.001±0.0000.065±0.01231 475.8±7 282.0271.8±39.0復(fù)方苦參高劑量640.1±33.369.32±0.000.162±0.0250.001±0.00139 081.6±9 120.4#389.6±87.9#

注：與對照組比較，#P<0.05；t1/2α(distribution half-life)：分布半衰期；t1/2β(elimination half-life)：消除半衰期；CL(clearance)：清除率；V(apparent volume of distribution)：表觀分布容積；AUC(area under curve)：血藥濃度-時間曲線下面積；MRT(mean residence time)：平均滯留時間

3 討論

肺癌是目前常見的癌癥之一，其中非小細(xì)胞肺癌約占80%，且發(fā)病率呈連續(xù)上升的趨勢[7]，臨床上首選個體化的化學(xué)治療方式進(jìn)行治療。吉西他濱作為治療非小細(xì)胞肺癌的一線藥物，是新型的阿糖胞苷類似物，主要作用于S期細(xì)胞，從而達(dá)到抗腫瘤作用[8]，對晚期非小細(xì)胞肺癌化學(xué)治療效果較好，但是在化學(xué)治療的過程中，由于患者體質(zhì)虛弱以及化學(xué)治療藥物具有一定的不良反應(yīng)，如吉西他濱具有血液、淋巴、胃腸等不良反應(yīng)[9]，因此，在臨床上吉西他濱作為化學(xué)治療藥物治療非小細(xì)胞肺癌受到了限制。復(fù)方苦參注射液是由苦參、山慈菇、靈芝、何首烏和土茯苓加工制成的純中藥制劑，實驗證實，復(fù)方苦參注射液可通過增強機體的免疫功能和抑制相關(guān)腫瘤血管生成因子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到抗腫瘤作用[10]，同時可以降低患者使用化學(xué)治療藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)[11]。

本研究結(jié)果表明，多劑量復(fù)方苦參注射液可以影響吉西他濱在大鼠體內(nèi)AUC(0-t)和MRT(0-t)，可以增加吉西他濱的作用時間和藥物濃度，但不能確切說明與藥效的關(guān)系，因為吉西他濱在體內(nèi)起藥效作用的是其代謝物[3]。根據(jù)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系分析，AUC(0-t)增加，半衰期延長，清除率和表觀分布容積下降，但本次實驗結(jié)果顯示，分布半衰期、消除半衰期、清除率和表觀分布容積都未有顯著變化，這可能是因為吉西他濱注射到體內(nèi)，不存在吸收過程，直接進(jìn)入血液，因此AUC(0-t)和MRT(0-t)更直觀表現(xiàn)出來；隨后，吉西他濱分布到組織，隨即由肝和腎在體內(nèi)消除，分布半衰期和消除半衰期以及清除率是反映這個過程的參數(shù)，而這個過程受很多因素干預(yù)，如代謝酶、轉(zhuǎn)運體。一方面吉西他濱是以被動易化轉(zhuǎn)運的方式進(jìn)入組織，轉(zhuǎn)運過程中被載體的競爭性底物所抑制[12]。另一方面，吉西他濱在進(jìn)入機體內(nèi)后一部分由脫氧胞苷激酶代謝變成活性的吉西他濱三磷酸鹽而發(fā)揮抗腫瘤作用，進(jìn)而經(jīng)體內(nèi)代謝酶代謝排出體外，另一部分直接由體內(nèi)代謝酶代謝后排出體外。目前，關(guān)于復(fù)方苦參與吉西他濱聯(lián)合使用與代謝酶的關(guān)系尚不明確，后期實驗將開展代謝方面的研究。

在以往研究中，單劑量復(fù)方苦參注射液與吉西他濱聯(lián)合使用后，吉西他濱在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)并未見有顯著改變[6]。但在本次研究中，多劑量復(fù)方苦參注射液與吉西他濱聯(lián)合使用后，吉西他濱的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)發(fā)生了變化。與對照組相比，復(fù)方苦參高劑量組AUC(0-t)和MRT(0-t)顯著升高和延長(P<0.05)。中西藥的相互作用與代謝酶(尤其是CYP450酶)息息相關(guān)，有研究表明，復(fù)方苦參注射液可以改變細(xì)胞色素P450酶活性[13]。而按照復(fù)方苦參注射液臨床治療1個療程的劑量及大鼠與人體劑量折算公式推算，多劑量試驗中對大鼠連續(xù)給予復(fù)方苦參注射液10 d，由于連續(xù)多次給予復(fù)方苦參注射液，使其在體內(nèi)蓄積，當(dāng)蓄積到一定程度時，其體內(nèi)藥物濃度增加，活性也相對增加，使機體物質(zhì)發(fā)生改變，進(jìn)而對吉西他濱藥物代謝動力學(xué)參數(shù)AUC(0-t)和MRT(0-t)產(chǎn)生了影響。這可能是兩者雙重影響的結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，多劑量復(fù)方苦參注射液與吉西他濱聯(lián)合使用后，能夠顯著提高吉西他濱在大鼠體內(nèi)的AUC和顯著延長MRT，提示兩者聯(lián)用使用可達(dá)到增效作用。此外，本試驗以臨床聯(lián)合用藥療效為出發(fā)點，其結(jié)果為后期深入研究二者聯(lián)合用藥的增效減毒機制提供參考，也為今后探討中藥復(fù)方聯(lián)合抗腫瘤藥物治療腫瘤，以及更深入地揭示腫瘤藥物的作用機制、耐藥機制奠定了基礎(chǔ)，并有利于研發(fā)新的抗腫瘤藥物。