急性肝衰竭模型豬微環境對脂肪間充質干細胞生物學特性的影響

郭瑞紅 潘小平 侯曉麗張 悅 江夏薇 汪恬甜劉壽榮

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）移植治療終末期肝病獲得較多的關注，其來源眾多，主要包括骨髓、脂肪組織、羊膜、胎盤、臍帶血等[1-5]。動物實驗和臨床研究顯示，MSC移植治療終末期肝病，可明顯提高患者的生存率，改善患者肝功能。與骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）相比[6]，脂肪間充質干細胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）分化為肝細胞的潛能更大，并且從慢性乙肝患者身上分離出的ADMSCs在培養時不易感染乙型肝炎病毒，因此，ADMSCs更適合作為慢性乙型肝炎患者的細胞替代治療。Mohsin等人[7]在體外模型中用損傷的肝組織預處理MSC，結果顯示提高了MSC中肝細胞特異性基因的表達。從肝損傷大鼠中分離的血清提高了BMSCs的肝向分化功能，并且證明比肝細胞生長因子更為有效，這表明某些病理環境可能影響MSC的特征[8]。然而，尚不清楚肝衰竭患者的ADMSCs是否因肝功能障礙而改變，以及從終末期肝病患者中分離的ADMSCs是否是自體移植的潛在候選者。小型模型豬在解剖、生理和生物化學等方面與人類相似，可作為人類醫學研究的最理想的模型動物[9]，因此，本研究獲取豬ADMSCs進行比較。通過對比急性肝衰竭豬脂肪來源的間充質干細胞（adipose derived mesenchymalstem cellsfrom acute liverfailure porcine，ALF-ADMSCs）和正常豬來源的 ADMSCs（adipose derived mesenchymal stem cells from normal porcine，Nor-ADMSCs）的細胞形態，細胞表型，增殖能力，分化潛能等來鑒定急性肝衰竭對豬ADMSCs生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用雄性微型巴馬豬2只，體質量10～12kg，購自上海甲干生物科技有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2015-0005，由浙江中醫藥大學實驗動物中心[合格證號：SYXK（浙）2013-0184]飼養。飼養期間給予標準飼料及自由飲水，12h黑白循環燈光，恒定溫度及濕度。本研究經過浙江中醫藥大學實驗動物管理與倫理委員會審核通過（批準編號：1ACUC-20180326-10）。

1.2 主要儀器和試劑 儀器：PCR儀（美國Applied Biosystems公司）、倒置相差顯微鏡（德國ZEISS公司）、CO2培養箱（美國 Thermo公司）。試劑：D-半乳糖胺、油紅 O 染色液、胰島素（insulin）、3,3'，5-三碘L-甲狀腺原氨酸（T3）、吲哚美辛、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、羅格列酮（rosiglitazone）均購自美國sigma公司；丙泊酚（西安力邦制藥有限公司11712011）；RT-PCR 試劑盒（康為世紀公司 10209）；逆轉錄試劑盒 （TaKaRa ＃AK4802）；RNAiso Plus（TaKaRa 108-95-2）；成骨分化培養基（Gibco 1872976），成軟骨分化培養基（Gibco 1867431）；肝細胞生長因子（Peprotech 0510S201），成纖維細胞生長因子（Peprotech 041408-2），胰島素鐵硒傳遞蛋白（Sigma SLBN1805V）；CCK8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司032718180410）；茜素紅染色液（賽業生物科技有限公司T170113G001）；阿利新藍染色液(上海源葉生物科技有限公司L06D8G49787)；糖原染色試劑盒（sigma-alorich 061M4347）；小鼠單克隆抗體CD14-PE、CD105-PE以及同型對照PE-IgG2a均購自英國Abcam公司；引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.3 急性肝衰竭豬模型建立 兩只微型巴馬豬實驗前按照實驗動物標準飼養1周。1只用于制備Nor-ADMSCs。另1只通過頸靜脈注射D-半乳糖胺以建立急性肝衰竭模型豬。頸靜脈置管前肌肉注射氯胺酮4mg/kg，手術期間通過耳緣靜脈施用丙泊酚以2.5mg·kg-1·h-1提供持續麻醉。頸靜脈置管和麻醉在30min內完成操作。D-半乳糖胺溶于5%葡萄糖溶液中，用氫氧化鈉調節PH至6.8，再以0.22μm過濾器過濾后以1.5g/kg通過頸靜脈插管注入[10]。D-半乳糖胺誘導24h后，采用麻醉后放血法處死微型豬。收集血清和肝臟病理組織以檢測造模是否成功。

1.4 豬ADMSCs分離、培養 獲取微型豬腹部和頸部脂肪組織，分離好的脂肪組織在嚴格無菌條件下，用4℃含2%青鏈霉素的磷酸緩沖溶液（PBS）充分洗滌。在含有0.1%膠原酶溶液中充分切碎組織，37℃下消化90min。每隔15min用移液管吹打混勻，以免過度消化。加入低糖培養基終止消化，在室溫下離心（700g，10min），棄去上清液。再加入低糖培養基重懸細胞，100目篩網過濾，在室溫下離心（700g，10min）后，重新懸浮在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素和鏈霉素的低糖培養基中。隨后將細胞接種到T25培養瓶中，并置于37℃，5%CO2的培養箱中。當細胞達到70%～80%融合時，選擇形態均一、生長良好者按1：2或1：3傳代，每隔3d換液一次，第3代以后即可用于細胞表型鑒定及分化實驗。

1.5 細胞表型鑒定 取第3代豬ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs，用含體積分數為3%胎牛血清的PBS洗滌3次，制成單細胞懸液，調整細胞濃度至5×106/mL，加入熒光標記小鼠單克隆抗體CD14-PE、CD105-PE、CD44-FITC、CD90-FITC、CD29-FITC，PE-IgG2a、FITC-IgG2a、FITC-IgG1 作為同型對照。室溫避光孵育30min，PBS洗滌數次后用流式細胞儀檢測表面分子標記。

1.6 增殖能力測定 收集第5代對數生長期ALFADMSCs和Nor-ADMSCs，制備單細胞懸液，以每孔2000個細胞接種于96孔板（100μL/孔），并置于37℃，5%CO2的培養箱中培養。培養24h后取出一塊96孔板，每孔加入10μL CCK8溶液，隨后在CO2培養箱中孵育3h，酶標儀450nm處測定各孔吸光度值（OD值）。每天同一時間取出一塊96孔板重復以上操作，連續監測7d，每個時間點重復4次，計算每組細胞OD值。

1.7 多向分化潛能鑒定 取生長狀況良好的第4代ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs，接種于6孔板內，每孔1×105個細胞，待細胞達到100%融合后更換為成骨、成脂、成軟骨誘導培養基。其中，成骨分化加入成骨誘導培養基，每隔3d換液，連續培養21d后行茜素紅S染色。成脂分化誘導培養基配制如下：誘導培養第0d，即第一次加入誘導培養基，在含10%FBS的低糖培養基中加入insulin 5μg/mL，T3 1nM，吲哚美辛 0.125μM，地塞米松 2μg/mL，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 0.5mM，rosiglitazone 0.5μM。誘導培養第 2d，在含10%FBS的低糖培養基中加入insulin 5μg/mL，T3 1nM，rosiglitazone 0.5μM。誘導培養第 4d，在含 10%FBS的低糖培養基中加入insulin 5μg/mL，T3 1nM，rosiglitazone 1μM。第6d誘導培養基同第4d，共誘導8d，可見脂滴形成，并進行油紅O染色。成軟骨分化加入軟骨誘導培養基，每隔3d換液，連續培養21d后行阿利新藍染色。

誘導結束后用Trizol法提取細胞總RNA，RT-qPCR檢測成骨、成脂、成軟骨特異性標記物的表達。按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA（引物序列見表 1）。qPCR采用 UltraSYBR Mixture（Low ROX）說明書進行操作，反應條件如下：預變性：95℃ 10min，變性：95℃ 15s，退火延伸：60℃1min，40個循環。以 GAPDH為內參基因，Nor-ADMSCs和ALF-ADMSCs未分化細胞為對照組，計算兩組細胞成骨、成脂、成軟骨待測基因2-ΔΔCt值并進行數據處理，每組實驗至少重復3次。

1.8 成肝誘導分化及鑒定 參照參考文獻[11]的誘導方法，取生長狀況良好的第4代ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs，加入肝細胞生長因子20ng/mL，成纖維細胞生長因子20ng/mL，地塞米松40nmol/mL，1%胰島素鐵硒傳遞蛋白，含5%FBS的低糖培養基，每隔2d換液1次，觀察細胞形態，于誘導第21d進行糖原染色，并收集細胞鑒定類肝細胞特異性標志（引物序列見表1）。

1.9 統計學方法 應用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析，所有計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常豬和肝衰竭豬血清生化及病理學檢測結果

正常豬血清學指標如下：丙氨酸氨基轉移酶52.100IU/L、天門冬氨酸氨基轉移酶53.800IU/L、總膽紅素 1.740μmol/L、直接膽紅素 1.030μmol/L、血清總蛋白37.980g/L、白蛋白70.800g/L。肝衰竭豬血清學指標：丙氨酸氨基轉移酶437.300IU/L、天門冬氨酸氨基轉移酶13805.000IU/L、總膽紅素32.570μmol/L、直接膽紅素24.650μmol/L、血清總蛋白37.840g/L、白蛋白61.500g/L。與正常豬相比，肝衰竭豬血清中丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、直接膽紅素水平顯著升高，血清總蛋白及白蛋白降低。正常豬肝組織切片HE染色顯示肝小葉結構完整，無肝細胞腫大和壞死。肝衰竭豬肝組織切片可見肝細胞界限不清，呈大片狀壞死，壞死區可見炎癥細胞浸潤，肝竇淤血擴張（見插頁圖1）。血清學指標及病理組織學表明成功建立豬肝衰竭模型。

表1 引物序列

2.2 細胞形態比較 ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs在接種24h后均可見以散在的方式貼壁生長，以長梭形為主，散在一些多角形、長圓形細胞，細胞增殖較緩慢，原代培養第4d細胞達90%融合（圖2A、B）。按1：2傳代至第5代時，兩組細胞均增殖加速，細胞質豐富，細胞變大而扁平，同時以集落方式生長，呈漩渦狀分布（見插頁圖2C、D）。

2.3 流式細胞表型鑒定比較 流式細胞儀檢測結果顯示，第 3代 ALF-ADMSCs CD105、CD90、CD14表達陽性率分別為（79.47±6.78）%、（56.83±4.23）%、（0.17±0.05）%。第 3代 Nor-ADMSCs CD105、CD90、CD14 表達陽性率分別為（77.7±4.60）%、（59.47±7.49）%、（0.03±0.05）%。結果表明，ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs均高表達間充質干細胞表面標記CD105、CD90，不表達或低表達干細胞表面標記CD14（見插頁圖 3）。

2.4 細胞增殖比較 通過CCK8法對第5代ALFADMSCs和Nor-ADMSCs的生長趨勢進行了對比分析（表2）。通過比較兩組細胞450nm處OD值可以看出，兩組細胞的增殖速率十分相似，在第1～2d非常緩慢，處于細胞生長潛伏期，在培養第4d后進入對數生長期，第7d后細胞生長放慢。兩組細胞之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.5 多向分化潛能比較 在成骨誘導培養第21d，兩組細胞茜素紅S染色顯示，細胞胞漿內均可見被染為紅色的礦化結節（圖4A、B）。成脂誘導第8d，兩組細胞油紅O染色顯示，細胞胞漿可見小而圓的紅色脂肪滴（圖4C、D）。成軟骨誘導培養第21d，兩組細胞阿利新蘭染色可見單個分布的軟骨細胞，細胞呈不規則形，胞核呈圓形或橢圓形（見插頁圖4E、F）。RT-qPCR結果顯示，成骨分化21d后ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中成骨標記物[堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）、骨橋蛋白（osteopontin）]顯著增加，脂肪分化8d后ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中脂肪源性標記物[脂蛋白（LPA）和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARy2）]均顯著增加，軟骨分化21d后ALFADMSCs和Nor-ADMSCs中軟骨標記物[聚蛋白多糖（Aggrecan）和Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）]均顯著增加（表3）。

表2ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs細胞增殖能力比較（OD 值，±s）

表2ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs細胞增殖能力比較（OD 值，±s）

注：每個時間點重復4次，計算兩組細胞OD值；ALF-ADMSCs：急性肝衰竭豬脂肪間充質干細胞；Nor-ADMSCs：正常豬脂肪間充質干細胞

時間（天）1 2 3 4 5 6 7 n 4 4 4 4 4 4 4 Nor-ADMSCs 0.095±0.003 0.129±0.007 0.351±0.006 0.422±0.015 0.679±0.023 1.159±0.099 1.306±0.026 ALF-ADMSCs 0.101±0.004 0.164±0.004 0.380±0.005 0.464±0.012 0.690±0.031 1.238±0.022 1.384±0.034

2.6 成肝分化潛力比較 ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs誘導21d后，均可見不規則多邊形的類肝細胞形成，糖原染色可見細胞胞漿內紫色沉淀（見插頁圖 5）。

RT-qPCR檢測ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs成肝分化后兩組細胞白蛋白（ALB）、肝細胞生長因子（HGF）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）、肝細胞核因子-1A（HNF1A）和肝細胞核因子-1B（HNF1B）等肝細胞特異性標記物的表達，結果顯示，ALFADMSCs和Nor-ADMSCs均高表達肝細胞表面標記物，但兩組細胞間表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 兩組細胞成骨、成脂、成軟骨及成肝分化后特異性基因相對表達量（2-ΔΔCt值，±s）

表3 兩組細胞成骨、成脂、成軟骨及成肝分化后特異性基因相對表達量（2-ΔΔCt值，±s）

注：每個基因重復檢測 3 次，計算 2-ΔΔCt值。alkaline phosphatase：堿性磷酸酶；osteopontin：骨橋蛋白；Aggrecan：聚蛋白多糖；ColⅡ：Ⅱ型膠原蛋白；LPA：脂蛋白；PPARy2：過氧化物酶體增殖物激活受體；ALB：白蛋白；G6PD：葡糖糖-6-磷酸脫氫酶；HGF：肝細胞生長因子；HNF1A：肝細胞核因子-1A；HNF1B：肝細胞核因子-1B；ALFADMSCs：急性肝衰竭豬脂肪間充質干細胞；Nor-ADMSCs：正常豬脂肪間充質干細胞

基因alkaline phosphatase osteopontin Aggrecan colⅡLPA PPARy2 ALB G6PD HGF HNF1A HNF1B n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Nor-ADMSCs 3.241±0.062 2.903±0.584 2.702±0.601 5.411±1.301 74.242±8.383 5.802±0.222 2.603±0.321 2.831±0.382 2.432±0.532 2.014±0.303 2.512±0.164 ALF-ADMSCs 3.592±0.250 4.262±0.560 1.761±0.322 4.633±0.651 56.234±8.461 4.072±0.160 2.801±0.622 2.733±0.111 2.021±0.212 2.170±0.011 2.291±0.164

RT-qPCR檢測未分化ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中肝細胞特異性基因的表達，結果顯示，與Nor-ADMSCs相比，ALF-ADMSCs中HGF的表達高于 Nor-ADMSCs （12.48±0.59）倍（P＜0.01）。ALB、HNF1A、HNF1B、G6PD的表達兩組細胞差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 4。

3 討論

間充質干細胞可通過免疫調節、抗炎作用、旁分泌作用以及體內直接分化為肝細胞樣細胞，從而促進肝再生，發揮治療終末期肝病的作用[12]。研究表明，67（±0.8）mL大腿外側脂肪抽吸物中可得到12.31（±1.2）×106間充質干細胞，ADMSCs獲取方便，細胞產量相當可觀，在MSC治療肝臟疾病中引起了極大的關注[13]。多項急性肝衰竭動物模型表明，脂肪來源的MSCs可顯著改善模型動物的肝臟血清學指標，病理組織形態及生存率等[14-15]。

本研究主要比較兩種來源的ADMSCs的體外特征。結果顯示，兩組細胞形態并無差異，增殖能力相似，多向分化潛能相當，且均高表達間充質干細胞表面分子標記物，低表達造血干細胞標記物。ALFADMSCs可在體外誘導分化為類肝細胞，與Nor-ADMSCs相比，兩者成肝分化潛能相當。本研究結果顯示，ALF-ADMSCs高表達HGF。HGF具有抗細胞凋亡、抗纖維化和促細胞再生的功能，在肝細胞的發育和再生中起著不可替代的作用，其為各種組織來源的干細胞體外分化為肝細胞提供微環境，并且是分化為類肝細胞的關鍵因素。提示我們，ADMSCs在肝衰竭微環境的影響下高表達HGF，這將為細胞自體移植治療終末期肝病提供依據。

表4ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中肝臟特異性基因的表達量（2-ΔΔCt值，±s）

表4ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中肝臟特異性基因的表達量（2-ΔΔCt值，±s）

注：與 Nor-ADMSCs比較，**P＜0.01。每個時間點重復 4 次，計算 2-ΔΔCt；ALF-ADMSCs：急性肝衰竭豬脂肪間充質干細胞；Nor-ADMSCs：正常豬脂肪間充質干細胞；ALB：白蛋白；HNF1A：肝細胞核因子-1A；HNF1B：肝細胞核因子-1B；HGF：肝細胞生長因子；G6PD：葡糖糖-6-磷酸脫氫酶

基因ALB HNF1A HNF1B HGF G6PD n 3 3 3 3 3 Nor-ADMSC 1.000±0.060 1.000±0.060 1.000±0.060 1.000±0.060 1.000±0.060 ALF-ADMSC 0.791±0.145 1.524±0.132 1.502±0.291 12.484±0.593**0.764±0.082

綜上所述，肝衰竭不影響ADMSCs的細胞形態學，增殖能力，MSC特異性標記物的表達以及多向分化潛能。但ALF-ADMSCs可在體外高表達HGF，與Nor-ADMSCs體外成肝分化潛能相比，二者卻并無差異。有文獻報道[16]，過表達HGF的ADMSCs可顯著改善輻射誘導的大鼠肝損傷模型，增強ADMSCs的治療潛力，因此，還需在體內繼續驗證急性肝衰竭來源的ADMSCs是否優于正常供者來源的ADMSCs，進一步明確來自肝損傷患者的ADMSCs是否以某種方式改變進而影響其治療潛能。