紫蘇葉-黃芩藥對抑制神經氨酸酶活性的最佳配比研究*

汪靜宜 魯銀均 吳巧鳳#

1 浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

2 浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江 杭州 310006

中醫學認為，紫蘇葉可行氣和胃，解表散寒；黃芩擅清熱燥濕，瀉火解毒。臨床上，兩藥常以不同比例配伍出現在治療流感的方劑中。神經氨酸酶（NA）是流感病毒表面的一種包膜糖蛋白，在流感病毒的傳播過程中發揮重要作用。本文以藥對對NA活性的抑制率為評價指標，采用輻射設計法確定紫蘇葉-黃芩藥對的不同配比，通過響應曲面法評價不同配比的藥對與抑制NA活性的關系，以確定紫蘇葉-黃芩藥對的最佳配比。

1 材料

1.1 藥材：紫蘇葉（批號：171001；產地：浙江）和黃芩（批號：170701；產地：內蒙古）均購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠，并經浙江中醫藥大學中藥資源教研室俞冰副教授鑒定，分別為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的葉和唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

1.2 試劑：神經氨酸酶抑制劑篩選試劑盒P0309[包含1ml神經氨酸酶熒光底物2′-（4-methylumbelliferyl）-D-N-acetylneuraminic acid（MUNANA）、50μl神經氨酸酶、10ml神經氨酸酶檢測緩沖液和1.20ml Milli-Q水，碧云天生物技術研究所]；生理鹽水（批號：B16010402，浙江國境藥業有限公司）；奧司他韋膠囊（批號：M1025，瑞士巴塞爾豪夫邁·羅氏有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器：熒光酶標檢測儀（FLUOstar OPTIMA，德國BMG公司）；熒光酶標板（96孔，美國COSTAR公司）；電子分析天平（AB135-S，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超速離心機（Centrifuge 5810R，德國Eppendorf公司）；超聲波清洗器（KQ5200，昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 藥對的配伍設計與制備：實驗采用輻射設計，將二維坐標分為8個等分[1]，得到9種不同的配伍比例（1:0、5:1、5:2、3:2、1:1、2:3、2:5、1:5、0:1），具體見圖1（紫蘇葉:黃芩以蘇-芩表示）。分別精密稱取紫蘇葉、黃芩粗粉，混勻，每份均設為15g，用20倍量的水煎煮2次，每次1h，趁熱過濾，合并濾液，濃縮濾液至相當于含生藥量0.5g/ml，得相應的藥對提取液，于4℃冷藏，臨用時以生理鹽水稀釋至所需濃度。

圖1 紫蘇葉-黃芩藥對9個不同配比

2.2 神經氨酸酶抑制率的測定[1-2]：取96孔熒光酶標板，設置酶對照組、空白對照組、陽性對照組（奧司他韋，5個不同濃度：0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml）及藥對組（9個不同配比），每組3孔。各組加入神經氨酸酶檢測緩沖液70μl/孔，再各加神經氨酸酶10μl/孔（空白組不加），陽性對照組加5個不同濃度的藥液，藥對組加9個不同配比的藥液（各稀釋7個濃度）。振蕩混勻約1min后，37℃下孵育2min，以使抑制劑和神經氨酸酶充分相互作用，然后每孔加入10μl神經氨酸酶熒光底物，振蕩混勻約1min后，37℃下孵育20min后進行熒光測定（激發波長360nm，發射波長440nm），計算抑制率及半抑制濃度（IC50）。測定結果見表1（其中奧司他韋的IC50為0.021mg/ml，酶對照組抑制率視為0）。各組數據與酶對照組均具有顯著性差異（P＜0.05）。

由表1可知，藥對配比在1:1左右時，其IC50最小，提示紫蘇葉-黃芩藥對在1:1配比時對神經氨酸酶抑制 活性作用最佳。

表1 各組對NA活性的抑制率（n=3）

2.3 藥效學模型：中藥具有多成分多靶點共同作用的特點，采用二次多項式描述紫蘇葉和黃芩兩藥合用的量效曲線，響應指數表示其相互作用強度。將響應指數減1，以0為典型的加和作用，便于繪圖。結果見圖2。

2.4 相互作用評價：在三維響應曲面模型圖中，顏色深淺表示兩藥相互作用的強度。當響應指數接近于0時，藥物間表現為相加作用；大于0時，表現為拮抗作用；小于0時，表現為協同作用。指數值越高，則相互作用強度越大，響應曲面圖中表現為顏色接近于淺色或深色兩端。X軸表示不同劑量的黃芩單味藥，Y軸表示不同劑量的紫蘇葉單味藥，Z軸表示藥對在不同劑量下的抑制率。采用SPSS17.0軟件處理數據，實驗數據用-x±s表示，采用Matlab軟件進行擬合模型確定參數。以流感病毒NA活性抑制率為評價指標，擬合三維響應曲面模型，見圖2。當紫蘇葉、黃芩配比在1:0.92～1:1.67之間時，其協同作用顯著（協同作用強度-0.80）。其他配比協同作用較弱，或產生相互作用甚至具有拮抗作用。

圖2 藥對三維響應曲面圖

3 討論

本文采用底物熒光檢測法考察紫蘇葉-黃芩藥對不同配比對神經氨酸酶的抑制作用，發現紫蘇葉-黃芩藥對配比為1:1時，IC50最小。結合前期對“中國方劑數據庫”中含紫蘇葉-黃芩藥對的古方統計分析結果，發現1:1配比出現的頻率最高（占總數的25.6%）；在主治普通感冒及流感的方劑中，1:1配比出現的頻率也最高（占總數的44.4%），與本實驗結果一致，從而反映藥對在方劑中使用的科學性。響應曲面圖是由特定的響應值與對應自變量所構成的三維圖，可直觀地反映出各自變量對響應值的影響[2-3]。響應曲面法可定性、定量地研究藥物間藥效學相互作用規律，并能尋找最佳閾值反應范圍[4]；輻射設計是一種從全局考慮藥物不同配伍比例的方法，相比僅憑臨床經驗的少數幾個參數設計更全面合理。輻射設計-響應曲面分析法兩者合用，目前已應用于多種藥對[1，5]與相關藥效間的最佳配比研究。本文采用該方法探討紫蘇葉-黃芩藥對不同配伍比例對抑制神經氨酸酶活性的影響，發現紫蘇葉:黃芩在1:0.92～1:1.67時，協同作用明顯，結合古方分析，最終確定1:1為抗流感病毒神經氨酸酶最佳配比。本文結果可為紫蘇葉-黃芩抗流感病毒配伍比例的選擇提供參考，并為其他相關研究提供思路與方法。

4 參考文獻

[1]陳高，吳巧鳳，張小霞，等.黃連-厚樸藥對9個配伍比例對抑制神經氨酸酶活性的影響[J].中成藥，2017，39(7)：1394-1397.

[2]崔文燕，劉素香，趙艷敏，等.響應曲面法優化黃花敗醬總皂苷提取工藝及體外促進腸平滑肌收縮活性[J].中草藥，2016，47（12）：2078-2083.

[3]呂佳妮，陳素紅，徐娟華.鐵皮石斛根中石斛多糖的響應面法提取優化研究[J].浙江中醫雜志，2014，49（6）：459-461.

[4]史旭芹，尚爾鑫，唐于平，等.基于響應面法對當歸-黃芪配伍養血補血功效相互作用研究[J].藥學學報，2012，47（10）：1375-1383.

[5]黃美艷，唐于平，尚爾鑫，等.基于響應面法對歸芎藥對活血效應相互作用研究[J].中國藥理學通報，2012，28（10）：1407-1412.