陽離子光敏抗菌型水凝膠的制備及性能表征

董建成，葛孝棟，王清清，魏取福

(江南大學 生態紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

近年來，細菌感染屢見不鮮，耐藥性病株的出現使得人們對于一些感染病例束手無策，迫切需要開發新的抗菌劑及研究方法來解決這個問題。常用的抗菌劑有重金屬[1]、季銨鹽[2]、殼聚糖[3]等，但這些常規抗菌劑往往會產生耐藥性。光動力抗菌化學療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)[4]作為最具前景的新療法之一，有望替代抗生素和常規抗菌劑用于感染方面的治療。PACT基于光動力療法(photodynamic therapy, PDT)，利用光敏劑在可見光的照射下產生光毒性單線態氧(1O2)滅活微生物。1O2沒有特異性的靶目標，因此PACT在滅菌的過程中不易使微生物產生耐藥性[5]。PACT常用的光敏劑有亞甲基藍、卟啉類等，由于自身所帶的正電荷使得其對細菌具有良好的抗菌效果[5]。將光敏劑固定化，為其持續和可重復利用提供了條件。目前，光敏劑在殼聚糖、硅膠、甲基丙烯酸衍生物等各種載體上的固定化已被廣泛研究[6-7]。但關于陽離子光敏劑在水凝膠基材上的負載，其用于光動力抗菌方面的研究較少。相比于其他的材料，水凝膠具有良好的生物相容性、可加工性、特定的刺激響應性。用其作為基體材料可以通過多種方式實現光敏劑的固定化，在諸多領域具有廣泛的用途[8]。

本工作首先通過MMT特有的層間陽離子交換性能，分別吸附3種陽離子光敏劑，然后將其均勻分散在PVA-SbQ溶液中，然后利用紫外光交聯法，使SbQ基團發生光二聚反應，分子鏈之間發生交聯，形成具有三維網絡結構的水凝膠。分析光交聯過程中光照時間對光敏劑性能的影響及水凝膠的溶脹性能，最后探究3種水凝膠對金黃色葡萄球菌的光敏抗菌效果。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

PVA-SbQ(苯乙烯吡啶鹽的摩爾分數為4.1%)，上海廣毅印刷器材科技有限公司；無機納米蒙脫土，浙江豐虹新材料股份有限公司；亞甲基藍(MB)、meso-四(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟吩對甲苯磺酸鹽(TMPyP)、meso-四(N-甲基-4-吡啶)卟吩四氯化鋅(Zn-TMPyP)，上海維塔試劑有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC6538)，上海協久生物科技有限公司；PBS緩沖液(pH=7.4)，自制；去離子水，江南大學后勤管理中心。

1.2 紫外光交聯法制備光敏抗菌型水凝膠

經反復超聲處理配制0.1%(質量分數)的MMT溶液，然后分別取1mL濃度為100μmol/L的TMPyP，Zn-TMPyP，MB水溶液和1mL的MMT溶液加入燒杯，攪拌均勻后加入5mL質量分數為50%的PVA-SbQ水溶液，磁力攪拌30min后，將混合溶液轉移到聚PTFE培養皿中。在培養皿上方覆蓋一層保鮮膜防止水分蒸發，最后將其放置在氙燈(配置365nm濾光片)下照射2h，得到光敏抗菌型水凝膠。

1.3 光敏劑光漂白測試

分別配制濃度為25μmol/L的TMPyP，Zn-TMPyP水溶液和50μmol/L的MB水溶液。以去離子水的吸收光譜作為基線，掃描波長范圍為300～650nm。分別取4mL對應的光敏藥物溶液在氙燈(配置365nm濾光片)下照射1～5h，每小時掃描一次溶液的吸收光譜。同樣的方法，移除365nm濾光片，配置420nm濾光片(λ≥420nm)在氙燈下照射0～120min，每隔10min在波長420.7，434.8，664nm處測3種溶液的吸光度變化。

1.4 水凝膠溶脹性能測試

將所得3種水凝膠凍干膜裁剪成小塊，每種水凝膠膜分為3個平行組。把水凝膠膜浸沒在過量去離子水中，在25℃恒溫水浴鍋中放置，每隔1h取出水凝膠，用濾紙拭去表面的水分，然后在電子天平上稱重，直至達到溶脹平衡。水凝膠溶脹比S為：

(1)

式中：WR，W0分別為每小時水凝膠吸水后的質量和干凝膠的質量。

1.5 抗菌測試

參考AATCC 100-2012對水凝膠光敏抗菌性能進行評價。在水凝膠凍干膜樣品上剪取若干個形狀、厚度均一的圓形試樣，平鋪于24孔板內。取0.1mL濃度為1×108～3×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液(PBS緩沖液)接種在各試樣上。每個樣品均分為兩組，分別置于光照及暗室的環境下培養30min，隨后在含有試樣的對應的24孔板內加入0.9mL PBS緩沖液，混合均勻后將原菌液及試樣上的菌液在離心管中依次等梯度稀釋106倍，制作出10倍稀釋系列。分別從稀釋系列的各離心管中取10μL溶液注入含瓊脂培養基的平板上，置于37℃的恒溫培養箱中培養24h。最后對其菌落數測定，計算出細菌存活率，對抗菌效果進行評價。

1.6 其他分析測試

用S-4800型掃描電子顯微鏡進行水凝膠表面形貌分析；用JEOL-2010型透射電子顯微鏡對MMT和水凝膠進行表征；用Q500熱重儀分析水凝膠的熱性能(升溫速率為10℃/min，最高溫度為600℃)。

2 結果與分析

2.1 水凝膠的形貌結構

圖1為TMPyP，Zn-TMPyP和MB 3種光敏劑的水凝膠的實物圖與SEM圖。由圖1(a-1),(b-1),(c-1)可知，水凝膠的外觀均質透明，勻整統一，3種水凝膠均呈現出光敏劑特征的顏色屬性。MMT通過層間陽離子交換作用吸附光敏劑[9]，避免了光敏劑團聚現象的產生[10]，這是均質水凝膠成型的基礎。

圖1 TMPyP(a)，Zn-TMPyP(b)和MB(c)水凝膠的實物圖與SEM圖(1)實物圖；(2)縱切面；(3)橫切面Fig.1 Digital images and SEM images of TMPyP(a),Zn-TMPyP(b) and MB(c) hydrogels(1)digital images;(2)longitudinal sectional images;(3)cross sectional images

由圖1(b-2)，(c-2)縱切面觀察到，水凝膠具有聯通的多孔三維網絡結構，圖1(b-3),(c-3)的橫切面形成連續的片層結構，MMT/TMPyP水凝膠電鏡圖尤為明顯。這是由于在冷凍過程中，凝膠中的水在低溫條件下成核結晶，形成冰峰，隨著熱量的傳遞，冰峰逐漸接近凝膠表面，形成貫通的冰柱，低壓條件下冰柱干燥升華，形成水凝膠的多孔結構[11-12]。這種多孔結構極大增加了水凝膠的比表面積，有利于光敏劑的釋放及其與底物接觸。

圖2為MMT，MMT/TMPyP水凝膠的TEM圖。

從圖2(a)中可以看出，經過超聲處理后，MMT片層結構被撐開，顯示出MMT的片層條紋結構，顏色較深的是MMT片層，顏色較淺的為片層間隙[13]。圖2(b)中吸附TMPyP的片層MMT均勻分散在PVA-SbQ載體中，從微觀層面說明了圖1中均質穩定水凝膠的成型。

圖2 MMT(a)，MMT/TMPyP(b)水凝膠的TEM圖Fig.2 TEM images of MMT(a) and MMT/TMPyP(b) hydrogels

2.2 光敏劑的光漂白

圖3為3種光敏劑的紫外光及可見光漂白曲線。光漂白是指光敏劑與光子相互作用時，除生成1O2外，還會伴隨著發生光降解、光締合等其他光化學副反應[14]，破壞光敏劑的分子結構，降低光敏化能力。圖3(a)，(b)，(c)分別為TMPyP，Zn-TMPyP，MB的紫外光漂白曲線。可以看出，即使經過5h的紫外光照射，光敏劑的吸收曲線均沒有發生明顯降低，保證了水凝膠制備過程中光敏劑的光敏化性能。

圖3(d)為3種光敏劑的可見光漂白曲線。可知，在可見光照射下(λ≥420nm)，3種光敏劑均發生部分光降解。兩種卟啉類光敏劑較為穩定，而MB光降解達到49.7%。MB是氮硫雜蒽化合物形成的三環狀結構，而卟啉是由26個π電子形成的高度共軛大環結構，因此卟啉的穩定性高于MB。與TMPyP相比，Zn-TMPyP中Zn2+的存在使得卟啉環在與光子的相互作用中更容易產生電子躍遷[15]，因此Zn-TMPyP的降解速率高于TMPyP。

圖3 TMPyP，Zn-TMPyP和MB光敏劑的紫外光及可見光漂白曲線(a),(b),(c)TMPyP，Zn-TMPyP，MB的紫外光漂白曲線；(d)3種光敏劑的可見光漂白曲線Fig.3 UV bleaching curves and visible light bleaching curves of the TMPyP，Zn-TMPyP and MB photosensitizers(a),(b),(c)UV bleaching curves of the TMPyP,Zn-TMPyP and MB;(d)visible light bleaching curves of the three photosensitizers

2.3 水凝膠的溶脹性能

圖4為3種光敏水凝膠的溶脹性能曲線。可知，3種水凝膠的溶脹趨勢基本一致，隨著時間的增加，溶脹速率都呈線性增長，12h后基本達到溶脹平衡，3種水凝膠平衡溶脹比迥異。溶脹過程中，水分子從外部滲透到水凝膠體系內，使其溶脹，同時聚合物分子鏈的擴展使三維網絡結構受到應力作用，使分子網產生收縮趨勢，當兩種相反的傾向相互抵消時，達到了溶脹平衡[16-17]。3種水凝膠的平衡溶脹比大小不同，可能與光敏劑分子量大小相關。TMPyP，Zn-TMPyP和MB分子量依次降低，與MMT結合后形成的粒徑大小也依次降低，因此MMT/PS在水凝膠中填充的網絡空隙大小不同，當水凝膠浸沒在水中時，部分MMT/PS會脫離出來，對應的網絡空隙由水分子填充。TMPyP，Zn-TMPyP和MB水凝膠的網絡空隙逐漸減小，因此對應溶脹比依次減小。

圖4 3種光敏水凝膠的溶脹性能Fig.4 Swelling property of the three photoactive hydrogels

2.4 水凝膠的熱學性能

圖5 3種光敏水凝膠的TGA曲線和TMPyP水凝膠的DTG曲線Fig.5 TGA curves of the three photoactive hydrogelsand DTG curve of the TMPyP hydrogel

2.5 水凝膠的光敏抗菌性能

圖6為3種光敏水凝膠對金黃色葡萄球菌的抗菌效果。可以看出，水凝膠對金黃色葡萄球菌均具有一定的殺滅效果。在光照及暗室培養環境下，對照組均未產生抗菌效果，而復合了光敏劑的Zn-TMPyP，TMPyP和MB水凝膠，在可見光照射條件下(λ≥420nm)細菌的存活率分別為1.51%，47.26%，74.58%，對應光敏劑游離時的1O2量子產率分別為0.88，0.74，0.49[20]。光敏劑的1O2量子產率越高，其光動力抗菌效果越佳，然而光敏劑被負載后光敏化性能下降[5]。負載MB的水凝膠光敏抗菌性能較差，可能是由于30min光照使其部分光降解，導致其光敏化能力降低。光照30min后，2種卟啉光敏劑的降解率較低，但TMPyP水凝膠的殺菌效果一般，可能是因為其1O2量子產率低于Zn-TMPyP，被負載后量子產率進一步降低。Zn-TMPyP對金黃色葡萄球菌的殺滅效果達到98.49%，具有最好的抗菌效果。一方面是因為高1O2量子產率，另一方面，Zn-TMPyP中Zn2+對細菌有一定殺滅效果。在暗室條件下，水凝膠有一定的抑菌效果，這可能是由于光敏劑穿透細菌細胞壁，進入細胞內對細菌DNA產生損害導致細菌裂解所致[21]。

圖6 3種光敏水凝膠對金黃色葡萄球菌的抗菌效果Fig.6 Antibacterial effects of the three photoactive hydrogels against staphylococcus aureus

3 結論

(1)成功制備了TMPyP，Zn-TMPyP和MB 3種陽離子光敏抗菌水凝膠。其外觀均質透明、勻整統一。制備過程中，紫外輻射不會影響光敏劑光敏化性能，冷凍干燥后內部形成聯通的三維網絡多孔結構，具有良好的溶脹性能。

(2)3種光敏水凝膠熱分解性能基本一致，光敏劑的存在不會影響載體熱學性能。

(3)Zn-TMPyP水凝膠具有最佳的光敏抗菌效果，其對金黃色葡萄球菌的殺滅效果達到98.49%，另外2種水凝膠也具有一定的抑菌效果。