隱丹參酮抗肺腺癌作用的研究

楊興輝 王海兵

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的首要原因，我國(guó)肺癌死亡率也居各種惡性腫瘤死亡率的第一位[1]。肺腺癌是肺癌中最主要的病理類型，其發(fā)病率約占肺癌總數(shù)的30%～40%[2]。目前化療仍是治療肺腺癌的重要手段，但是對(duì)任何一種化療藥物來(lái)講，均存在耐藥性或抗藥性以及毒性問(wèn)題，即使是以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的化療新藥也存在抗藥性問(wèn)題。在克服耐藥性和毒性方面有不少研究者傾向于天然抗腫瘤藥物的成分及其衍生物。隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）是從唇形科植物丹參根部中提取的一個(gè)脂溶性二萜醌類化合物。研究表明CPT具有抗炎、抗血管生成、抗糖尿病和抗腫瘤的作用[3-6]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CPT主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，如肝癌細(xì)胞HepG2和乳腺癌細(xì)胞MCF7[7]、黑色素瘤細(xì)胞A375[8]、卵巢癌細(xì)胞A2780[9]、慢性粒細(xì)胞白血病K562[10]等。然而關(guān)于CPT對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用人肺腺癌細(xì)胞株A549和PC-9，研究CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞增殖、凋亡的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路在其中的作用，為CPT的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 RPMI 1640（批號(hào)：2017082301）和高糖DMEM（批號(hào)：2017082302）細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于杭州科易生物技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：1709120206）購(gòu)于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；FBS（批號(hào)：1227693）購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：50510）購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；CPT粉劑（批號(hào)：S228530）購(gòu)于美國(guó)Selleck公司，純度＞99%，溶于DMSO中，配制成10mmol/L的儲(chǔ)存液，于-20℃保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度。CCK-8（批號(hào)：KL773）購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：2279795）、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（批號(hào)：5113741）和流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACS-Cantoll）購(gòu)于美國(guó)BD公司；ECL顯色試劑盒（批號(hào)：15289A4）購(gòu)于美國(guó)MERCK公司；實(shí)驗(yàn)用蛋白檢測(cè)抗體均購(gòu)于美國(guó)CST公司。CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：3111）、生物安全柜（型號(hào)：1374）、低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：Legend Micro 17R）和多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Thermo Varioskan Flash）購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；倒置熒光顯微鏡（型號(hào)：IX71）購(gòu)于日本Olympus公司；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：PowerpacTMBasic）和凝膠顯微成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDoc XRS System）購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株A549和PC-9由本實(shí)驗(yàn)室保存，分別使用添加10%FBS的RPMI 1640和高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3d換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和PC-9細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔接種50μl細(xì)胞懸液，共5 000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)12h后，對(duì)照組每孔加入含DMSO的培養(yǎng)基50μl，加藥組每孔加入含CPT的培養(yǎng)基 50μl，使 CPT 終濃度為 1、2.5、5、7.5、10、15 及20μmol/L，且保證每孔DMSO含量均為0.1%。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另設(shè)空白對(duì)照組，加入100μl培養(yǎng)基用于分析數(shù)據(jù)時(shí)去除背景。不同濃度的CPT分別作用24和48h后，每孔加入CCK-8試劑10μl，繼續(xù)培養(yǎng)30min，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度（OD）值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=加藥組平均值/對(duì)照組平均值×100%，利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，求出CPT對(duì)細(xì)胞50%生長(zhǎng)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和PC-9細(xì)胞分別接種于6孔板，每孔接種1ml細(xì)胞懸液，共2×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)12h后，對(duì)照組每孔加入含DMSO的培養(yǎng)基1ml，加藥組每孔加入含CPT的培養(yǎng)基1ml，使CPT終濃度為15μmol/L，且保證每孔DMSO含量均為0.1%。分別于0和24h用光學(xué)顯微鏡觀察，在倒置熒光顯微鏡下照相。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 根據(jù)Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。收集不同處理組細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞數(shù)為 1×105個(gè)/ml，取 1ml于 1 000r/min 離心 5min，棄上清液，用PBS漂洗1次后，加入Annexin V binding buffer 500μl混勻，制成單細(xì)胞懸液，再分別加入Annexin VFITC和PI染色液各5μl，輕柔混勻，室溫下避光孵育15min，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位 根據(jù)JC-1使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。收集不同處理組細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml，取1ml于1 000r/min離心5min，棄上清液，用PBS漂洗1次后，再加入JC-1溶液500μl混勻，37℃避光孵育 15min，1×Assay buffer漂洗 2次，加入1×Assay buffer 500μl混勻，制成單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 凋亡相關(guān)蛋白 cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）和STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化（p-STAT3）蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。收集不同處理組細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，根據(jù)細(xì)胞沉淀量加入適量RIPA細(xì)胞裂解液，冰上放置30min，每隔5min振蕩1次，4℃下 12 000r/min離心30min，收集上清液，按照BCA法測(cè)定蛋白含量。取各組樣品等量總蛋白50μg，加入等體積的2×上樣緩沖液，振蕩混勻，煮沸變性5min，12 000r/min離心1min，取上清液，按預(yù)定順序上樣，在10%SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳，以初始電壓60V進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍譓arker分開(kāi)后換用100V電泳至膠下緣1cm以上結(jié)束。轉(zhuǎn)膜條件為250mA恒流，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為100min，使用PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2h，一抗4℃孵育過(guò)夜，1×TBST緩沖液洗膜3次，每次5min，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶1 000），室溫孵育 2h，棄二抗，1×TBST 緩沖液洗膜3次，每次5min，膜上滴加底物發(fā)光的ECL顯影液，孵育后用ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。<斜體> P斜體＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞存活率的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示CPT可強(qiáng)烈抑制A549和PC-9細(xì)胞的增殖，該作用呈濃度和時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖1。A549細(xì)胞24 和 48h 的 IC50值分別為 8.915（95%CI：5.333～11.799）和 6.625（95%CI：4.337～8.478）μmol/L，PC-9 細(xì)胞 24 和48h 的 IC50值分別為 6.995（95%CI：4.815～8.794）和3.836（95%CI：2.015～5.246）μmol/L。在 A549細(xì)胞中，2.5、5、7.5、10、15、20μmol/L 的 CPT 作用 24h 的細(xì)胞存活率與對(duì)照組（0μmol/L）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；不同濃度的CPT作用48h的細(xì)胞存活率與對(duì)照組（0 μmol/L）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖1a。在PC-9細(xì)胞中，不同濃度的CPT作用24和48h的細(xì)胞存活率與對(duì)照組（0μmol/L）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖 1b。不同細(xì)胞株對(duì)CPT的敏感性存在顯著差異，A549細(xì)胞的存活率高于PC-9細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞存活率的影響（a：CPT對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響；b：CPT對(duì)PC-9細(xì)胞存活率的影響；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.2 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞形態(tài)的影響 15μmol/L CPT作用于A549和PC-9細(xì)胞24h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象：數(shù)量明顯減少，胞體變圓、縮小。

2.3 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，CPT作用24h對(duì)A549和PC-9細(xì)胞均有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。在A549細(xì)胞中，7.5、10和15μmol/L CPT 組的細(xì)胞凋亡率分別為（14.04±0.16）%、（35.43±0.40）% 和（41.50±0.57）%，明顯高于對(duì)照組的（6.84±0.20）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；在 PC-9細(xì)胞中，7.5、10和15μmol/L CPT組的細(xì)胞凋亡率分別為（16.07±0.22）%、（22.09±0.18）%和（30.61±0.67）%，明顯高于對(duì)照組的（5.08±0.17）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖2 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞凋亡的影響（a：各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖；b：各組細(xì)胞凋亡率；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.4 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響 與對(duì)照組比較，CPT均能降低A549和PC-9細(xì)胞的線粒體跨膜電位。15μmol/L CPT作用于A549和PC-9細(xì)胞24h后，線粒體跨膜電位分別為（54.56±0.51）%和（32.25±0.42）%，分別低于對(duì)照組的（84.42±0.56）%和（92.52±0.56）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞線粒體膜電位的影響（a：各組細(xì)胞線粒體膜電位流式細(xì)胞圖；b：各組細(xì)胞線粒體膜電位；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.5 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞中Caspase凋亡通路的影響 7.5μmol/L CPT作用于A549和PC-9細(xì)胞24h后，可觀察到cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白的表達(dá)。同時(shí)隨著CPT濃度的增加，2株細(xì)胞中 cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平明顯增加，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明此時(shí)細(xì)胞中Caspase凋亡通路已被激活，見(jiàn)圖4。

圖4 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞Caspase凋亡通路的影響（a：各組細(xì)胞cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)電泳圖；b：各組細(xì)胞cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.6 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞中STAT3通路的影響經(jīng)不同濃度的CPT處理24h后，A549和PC-9細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)水平下降，且在PC-9細(xì)胞中呈劑量依賴性，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖 5。

圖5 CPT對(duì)A549和PC-9細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的影響（a：各組細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)電泳圖；b：各組細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

3 討論

CPT作為丹參的主要活性成分之一，具有顯著的抗腫瘤作用[11]，但是對(duì)肺腺癌的作用研究甚少。本研究中，CCK-8結(jié)果證實(shí)CPT能夠抑制肺腺癌細(xì)胞A549和PC-9的增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴性，提示CPT具有較強(qiáng)的抗肺腺癌的活性。

大多數(shù)藥物抗腫瘤作用的機(jī)制主要是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[12-16]。本研究中，CPT處理A549和PC-9細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少、胞體變圓、縮小，是典型的凋亡現(xiàn)象；同時(shí)，利用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，證實(shí)CPT可有效地誘導(dǎo)A549和PC-9細(xì)胞發(fā)生凋亡，該結(jié)果與先前CPT誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的研究結(jié)果相似，提示CPT通過(guò)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡從而實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞毒作用。

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括3種：內(nèi)源性途徑（又稱線粒體凋亡途徑）、外源性途徑（又稱死亡受體凋亡途徑）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。Ye等[8]發(fā)現(xiàn)CPT能夠顯著減少活性氧的產(chǎn)生，增加Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，降低B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達(dá)，最終誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞A375線粒體途徑的凋亡。Park等[17]研究證實(shí)，CPT通過(guò)阻止JNK和p38的激活，從而降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，隨后引發(fā)前列腺癌細(xì)胞DU145死亡受體凋亡途徑的凋亡。本研究從與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)的線粒體跨膜電位、下游的Caspase凋亡通路相關(guān)蛋白等方面入手，對(duì)CPT誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將CPT作用于A549和PC-9細(xì)胞后，線粒體跨膜電位降低，cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP蛋白表達(dá)水平明顯增加，且呈劑量依賴性。由此可見(jiàn)，CPT誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。

STAT3在許多腫瘤細(xì)胞中存在持續(xù)激活，并在腫瘤的起始與進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[18]。STAT3信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的增殖、細(xì)胞凋亡抑制、侵襲和轉(zhuǎn)移、新血管生成以及腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化等密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種原癌基因[19-20]。有證據(jù)表明抑制STAT3的活性可能是一個(gè)理想的藥物靶點(diǎn)。索拉菲尼通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路的激活，進(jìn)而增強(qiáng)TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體在胰腺癌細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)作用[21]。CPT通過(guò)阻止STAT3信號(hào)通路的激活，抑制結(jié)腸癌和腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，證明CPT是一種有效的STAT3抑制劑[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)CPT可減少A549和PC-9細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)，且在PC-9細(xì)胞中呈劑量依賴性，表明STAT3信號(hào)通路的抑制可能參與了CPT誘導(dǎo)的A549和PC-9細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

綜上所述，CPT在體外可顯著抑制A549和PC-9細(xì)胞的增殖，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑以及STAT3信號(hào)通路相關(guān)，這些為CPT在肺腺癌治療中的應(yīng)用提供了分子基礎(chǔ)和理論依據(jù)。