結晶樣視網膜變性患者的基因突變檢測

顏虹 陸勤康 王惠云

結晶樣視網膜變性（Bietti’s crystalline dystrophy，BCD）是一組以常染色體隱性遺傳為主要遺傳方式的視網膜退行性疾病，其臨床特征為視網膜后極部結晶樣物質沉積，伴進行性視力下降及視野縮小[1]。雖然大多數患者在20歲左右時即可根據典型的視網膜結晶樣物質沉積進行臨床診斷，但多數情況下，早期患者往往因為視功能損害輕微而未予及時就診，從而延誤診斷，單一的臨床診斷存在明顯的滯后性。自2004年Li等[2]發現了CYP4V2基因的13個突變位點，證實CYP4V2基因為BCD的致病基因以來，CYP4V2基因的突變位點不斷涌現[3-6]，至今發現的突變位點已高達82個[5]。因此，針對患者個體的精準化定位變得極為重要，對臨床表現為BCD癥狀的患者進行相關突變篩查，有利于加強BCD的診斷，并提供遺傳咨詢和產前診斷，實現優生優育。本研究對3個BCD家系進行CYP4V2基因的突變篩查，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017年6月至2018年2月就診于寧波市鄞州人民醫院眼科門診并確診為BCD的患者3例（即先證者）。從先證者出發，尋找并收集家系中其他成員納入研究。共搜集BCD家系3個，患者及其家系成員合計 20例，其中男 9例，女 11例；年齡 3～73（35.8±19.2）歲。先證者均為男性。同時招募150名無血緣關系的健康志愿者作為健康對照組進行CYP4V2基因測序比對，其中男 89 人，女 61 人；年齡 22～62（38.8±11.7）歲。本研究遵守赫爾辛基宣言，經寧波市鄞州人民醫院倫理委員會批準（2017KY616），參與本研究的個體均簽署知情同意書。

1.2 臨床檢查 對3個BCD家系的家系成員進行詳細的病史、家族史詢問及全面的眼科檢查并記錄。臨床檢查包括裸眼視力（5m視力表購于上海躍進醫用光學器械廠）、最佳矯正視力（BCVA）（日本拓普康DK-600綜合驗光儀）、裂隙燈下眼前節及眼底檢查（重慶康華瑞明科技股份有限公司SLM-5E）、眼底照相（北京高視遠望科技有限責任公司KOWA-nonmyda-DⅢ）、眼部光學相干斷層成像技術（OCT）檢查（德國海德堡Spectralis OCT+Multicolor）、視野檢查（德國蔡司 HUMPHTRY 750i）、電生理檢查（法國 METROVISION MonPack3）及眼底熒光造影檢查（德國海德堡Spectralis HRA）。

1.3 外周血DNA的提取與擴增 采集所有家系成員及健康對照組外周血 5ml，EasyPure Blood Genomic DNA Ki（t北京全式金生物技術有限公司，規格：50rxns，批號：Lot#M10420）提取基因組DNA。通過PCR擴增目標 DNA 序列，50.0μl反應體系中，DNA 模板 1.0μl，上、下游引物各1.0μ（l10μM），2×EasyTaqCR SuperMix 25.0μl，超純水 22.0μl。94℃預變性 5min，94℃變性 30s，50～65℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環，最后72℃延伸5min。CYP4V2基因11個外顯子的上、下游引物見表1。操作步驟及流程嚴格按照寧波市鄞州人民醫院實驗中心生化實驗室要求進行。

表1 CYP4V2基因11個外顯子的上、下游引物[7]

1.4 基因檢測 對經過PCR擴增的目標DNA序列產物進行直接測序，測序由上海桑尼生物科技有限公司完成，測序結果與Genbank、千人基因組計劃中的野生型CYP4V2基因參考序列（GenBank：KR710969.1）進行對比分析，同時與150名健康志愿者的基因測序結果進行比對，確定突變位點。

2 結果

2.1 BCD患者的臨床特征 3例先證者均為散發患者，家系圖見圖 1。家系 1（F1）及家系 3（F3）中的先證者（F1:Ⅱ:1和F3:Ⅱ:1）首發癥狀均為夜盲，分別發生在25和 34 歲，家系 2（F2）中的先證者（F2:Ⅱ:1）主訴“雙眼視力下降10余年”。3例先證者BCVA差異較大，從0.2～1.0不等；眼前節均未見明顯異常，眼底見不同程度的結晶樣物質沉積，伴或不伴視網膜色素上皮（RPE）層萎縮及色素沉著；視野檢查可見不同程度的視野缺損；3例先證者的臨床表現見表2。先證者F1:Ⅱ:1的雙眼眼底照相示：后極部大量散在黃白色結晶樣物質沉積（圖2，見插頁）；眼部OCT示：雙眼神經上皮外叢狀層信號紊亂，色/脈反射帶反射信號薄，黃斑區及高反光物質堆積（圖3）；雙眼視覺誘發電位示：雙眼b波波峰未見明顯延遲，但波峰下降；視網膜電圖（ERG）示：暗視下b波波幅下降（左眼較重），明視下未見明顯異常；雙眼眼底熒光造影示：全視網膜見透見與遮蔽熒光相間，后級部中央低熒光，周邊透見熒光（圖4）。先證者F2:Ⅱ:1眼部OCT示：雙眼黃斑區囊樣水腫，雙眼ERG示：暗視下b波振幅下降，OPS震蕩電位輕度下降，明視下b波振幅輕度下降。患者因就診時血壓高（180/110mmHg），而未行眼底熒光造影。先證者F3:Ⅱ:1因自身原因未完成全部眼科檢查。其余家系成員未見發病。

圖1 BCD患者家系圖（黑箭為先證者）

表2 3例先證者臨床表現

圖3 先證者F1:Ⅱ:1雙眼OCT圖所見，箭頭表示黃斑區及高反光物質堆積

2.2 基因檢測結果 先證者F1:Ⅱ:1和F2:Ⅱ:1檢測出c.802-8_810dell7insGC（Exon7del）突變，而 F1 和 F2 其他家系成員均未發現該突變。先證者F3:Ⅱ:1檢測出c.219T＞A（p.F73L）突變，F3其他家系成員中未見此突變。3個家系的所有成員均存在c.775C＞A（p.Q259K）突變。在健康對照組中進行驗證后發現150名健康志愿者均不存在 c.802-8_810dell7insGC（Exon7del）和 c.219T＞A（p.F73L）突變，但有32名健康志愿者存在c.775C＞A（p.Q259K）突變。基因測序結果見表3和圖5-7。

圖4 先證者F1:Ⅱ:1雙眼眼底熒光造影圖像（a：右眼早期熒光造影圖像；b：右眼晚期熒光造影圖像；c：左眼早期熒光造影圖像；d：左眼晚期熒光造影圖像）

表3 3例先證者基因測序結果

圖5 第7外顯子DNA測序圖（a：先證者F1:Ⅱ:1及先證者F2:Ⅱ:1 的 c.802-8_810dell7insGC 突變；b：除 F1:Ⅱ:1、F2:Ⅱ:1 外其余個體的基因測序結果）

圖6 第2外顯子DNA測序圖[a：先證者F3:Ⅱ:1的c.219T＞A（p.F73L）突變（黑箭）；b：除F3:Ⅱ:1外其余個體的基因測序結果，相應位點不存在突變]

圖7 第6外顯子DNA測序圖 （[a：3例先證者及其家系成員和32名健康志愿者基因測序圖，其上存在c.775C＞A（p.Q259K）突變（黑箭）；b：健康對照組中剩余健康志愿者基因測序圖，其上未發現相應突變]

3 討論

早在2000年時，就有研究發現BCD的發病與細胞色素氧化酶 P450（CYP450）相關[8]，隨后，人們找到了BCD的致病基因——CYP4V2基因[2]。該基因編碼蛋白CYP4V2，屬于CYP450超家族。CYP450主要參與內源性及部分外源性物質的代謝[9]，而CYP450超家族中的CYP1-4蛋白被普遍認為是多不飽和脂肪酸ω-3及ω-6氧化反應的催化劑[10]，推測BCD的發病與脂質代謝異常相關。最新一項研究顯示降低細胞內的游離膽固醇可能是BCD的一種有效療法[11]，但CYP4V2基因所主導的生化途徑尚未被闡明。BCD具有高度遺傳異質性，至今已發現的BCD致病突變位點達82個，遍布全部11個外顯子區域[5]。因此，針對個體的基因篩查以明確病變基因，對于BCD患者的診斷、治療及遺傳咨詢等有重要意義。

本文研究的3個BCD家系，先證者均具有明顯的BCD表現：首發癥狀為夜盲或視力下降，眼底存在典型的結晶樣物質沉積，伴有不同程度的RPE萎縮。筆者通過基因檢測發現了幾個突變位點（c.775C＞A、c.802-8_810dell7insGC、c.219T＞A、c.870T＞G、c.846T＞C），其中兩個為同義突變（c.870T＞G、c.846T＞C）不造成蛋白質改變。對于F1及F2，筆者通過基因篩查，找到了c.802-8_810dell7insGC突變。經國內外多項研究證實，這是東亞人群中最為常見的突變方式[12-13]，該突變引起的臨床表現多樣，國內外多項研究針對CYP4V2基因進行了一系列基因型-表型研究[14-19]，但未得出明確的結論。有研究指出，相較于其他突變，CYP4V2基因中存在c.802-8_810dell7insGC突變的BCD患者的臨床表現較為嚴重[15]，而擁有復合雜合突變c.802-8_810dell7insGC的臨床表現又較純合突變嚴重，可合并黃斑水腫、脈絡膜新生血管、黃斑裂孔等[6，14，18]。但也有研究指出 BCD患者的基因型-表型無明確關聯，Meng等[16]首次對中國BCD人群進行大樣本的人口特征及基因型-表型研究，發現兩者之間表現出高度變異性，但并不存在明確的基因型-表型關聯，提示環境因素在BCD進展中的重要作用。

F3中發現的c.219T＞A（p.F73L）突變最早報道于2014年，Yin等[6]在17例BCD患者的34對等位基因中檢出7個該突變。因為此突變在正常個體中未被發現，73號位的苯丙氨酸又是一個高度保守序列，再加上存在該變異的BCD患者未發現其他致病突變，故Yin等[6]認為c.219T＞A（p.F73L）為BCD的致病突變。之后Meng等[16]對92個BCD家系進行研究發現該突變的頻率為3/184，Tian等[3]的研究檢測到突變頻率為1/10，以上均表明c.219T＞A（p.F73L）突變可能為BCD的致病突變。F3中先證者F3:Ⅱ:1檢測出c.219T＞A（p.F73L）突變，而其他家系成員及150名健康對照志愿者中均未發現該突變，且在先證者F3:Ⅱ:1中未發現其他已明確報道的致病突變，由此推測c.219T＞A（p.F73L）突變可能為F3的致病突變。

此外，3個BCD家系的所有成員均檢測出c.775C＞A（p.Q259K）突變。2013年Rossi等[20]檢測了15例BCD患者的CYP4V2基因，發現2例c.775A＞C（p.K259Q）突變，他們判斷此為良性突變。2017年Jiao等[5]在58例BCD患者中發現4例c.775A＞C（p.K259Q）突變，并判斷它可能不是BCD的致病突變。而筆者將測序結果與Genbank、千人基因組計劃中的野生型CYP4V2基因參考序列（GenBank：KR710969.1）進行對比分析后發現c.775C＞A（p.Q259K）突變，且該突變不只存在于3例先證者身上，同樣存在于其他家系成員及32名健康志愿者中。故c.775C＞A（p.Q259K）突變可能不是BCD的致病突變，不具備相應的臨床意義，但先前報道的c.775A＞C（p.K259Q）突變的準確性有待進一步驗證。