紅景天苷對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機(jī)制研究

王金華 張葉青 陶濤濤 柯博熙 張丹紅

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由各種心、腦血管疾病導(dǎo)致的一種常見的臨床綜合征，患者主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性的認(rèn)知功能下降[1]。近年來，VD發(fā)病率呈上升趨勢，已成為僅次于阿爾茨海默病的第二常見的癡呆類型[2]。目前，對(duì)于VD仍沒有特效的治療方法。紅景天苷是從傳統(tǒng)中藥紅景天中提取出來的一種化合物，具有多種藥物活性，如改善缺氧狀態(tài)、抗腫瘤、抗疲勞和抗毒性等作用[3-7]。同時(shí)，大量研究證實(shí)紅景天苷對(duì)于不同癡呆模型相關(guān)的認(rèn)知功能具有明顯的改善作用[8-9]，但其作用機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制作VD模型，并通過水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠認(rèn)知功能的變化來評(píng)價(jià)紅景天苷對(duì)VD大鼠的治療效果，并探討其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性健康SPF級(jí)SD大鼠42只，體重230～280g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，動(dòng)物房環(huán)境噪音低于60dB，室溫控制在20～25°C，相對(duì)濕度50%～70%，給予動(dòng)物12h光照/12h黑暗交替的環(huán)境。所有動(dòng)物自由獲取食物與飲用水。所有動(dòng)物操作均嚴(yán)格遵守國際動(dòng)物保護(hù)與使用指南的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器和試劑 Morris水迷宮檢測系統(tǒng)購自上海欣軟信息科技有限公司，紅景天苷（ab120899，1mg），超氧化物歧化酶（SOD）（ab65354）、丙二醛（MDA）（ab118970）、TNF-α（ab100785）、IL-6（ab234570）ELISA試劑盒均購自英國Abcam公司。

1.3 大鼠VD模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、模型組和紅景天苷組3組，對(duì)照組大鼠12只，模型組和紅景天苷組各15只。模型組和紅景天苷組采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制作VD模型，具體操作如下：每只大鼠于手術(shù)前12h開始禁食，可進(jìn)水。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑發(fā)揮效果后將大鼠固定于操作臺(tái)上，消毒后沿頸部正中切開皮膚，顯露大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分離周圍組織后進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎。術(shù)后對(duì)皮膚進(jìn)行縫合并再次消毒，將動(dòng)物放入籠中室溫下自然蘇醒，正常進(jìn)食水。對(duì)照組給予同樣的操作，但只分離頸總動(dòng)脈不進(jìn)行結(jié)扎。紅景天苷組大鼠于造模后7d給予紅景天苷10mg/kg（1.5g溶于1L 0.9%氯化鈉溶液，6.7ml/kg）灌胃治療；對(duì)照組和模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液（6.7ml/kg）灌胃，3組均為1次/d，連續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)照組大鼠無死亡，模型組和紅景天苷組各死亡3只，行水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)每組大鼠各12只。

1.4 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠認(rèn)知功能 紅景天苷治療4周后行水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的差異，水迷宮一人電腦操作，一人動(dòng)物操作，均固定人員不變。水迷宮水池壁高為50cm，水深為40cm，水溫維持在20～24°C，水池直徑為150cm。在水迷宮的目標(biāo)象限正中心位置放置一個(gè)直徑為10cm的水下隱性平臺(tái)，平臺(tái)上表面位于水下1cm處。前5d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，4次/d，每次從不同入水點(diǎn)放入大鼠。每只大鼠面朝水池壁放入池中，記錄逃避潛伏期，即大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間。若大鼠120s內(nèi)未到達(dá)水下平臺(tái)，則將大鼠小心引導(dǎo)至平臺(tái)上，并讓其逗留15s，120s則為該大鼠逃避潛伏期時(shí)間。第6天，撤去水下平臺(tái)，記錄每組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間。水迷宮6d實(shí)驗(yàn)方案見表1。

表1 水迷宮實(shí)驗(yàn)方案

1.5 大鼠腦組織海馬MDA水平和SOD活性檢測 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取腦組織，分離海馬，裂解后勻漿在4°C條件下使用離心機(jī)離心10min（12 000×g），留取上清液。采用ELISA法檢測大鼠腦組織海馬MDA水平和SOD活性。所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 大鼠腦組織海馬TNF-α和IL-6水平檢測 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組另選取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取腦組織，分離海馬，裂解后勻漿在4°C條件下使用離心機(jī)離心5min（12 000×g），留取上清液。采用ELISA法檢測大鼠腦組織海馬TNF-α和IL-6水平。所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期與目標(biāo)象限停留時(shí)間比較與對(duì)照組相比，模型組和紅景天苷組大鼠逃避潛伏期均延長，目標(biāo)象限停留時(shí)間均縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠逃避潛伏期縮短，目標(biāo)象限停留時(shí)間延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

2.2 各組大鼠海馬MDA水平和SOD活性比較 與對(duì)照組相比，模型組和紅景天苷組大鼠海馬MDA水平均升高，SOD活性均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠海馬MDA水平降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表2 各組大鼠逃避潛伏期與目標(biāo)象限停留時(shí)間比較（s）

表3 各組大鼠海馬MDA水平和SOD活性比較

2.3 各組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平比較 與對(duì)照組相比，模型組和紅景天苷組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平比較（ng/ml）

3 討論

VD是老年人癡呆的第二常見的病因，患者不僅記憶下降，執(zhí)行功能也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重受損[10]。高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥和高同型半胱氨酸血癥是VD的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。目前對(duì)于VD的臨床治療仍無特效的治療方法。紅景天苷是紅景天的重要成分，具有多種藥物活性，如改善缺氧狀態(tài)、抗腫瘤、抗疲勞和抗毒性等作用[3-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，VD大鼠逃避潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短，說明VD大鼠的認(rèn)知功能與對(duì)照組相比明顯受損；經(jīng)紅景天苷治療后，VD大鼠逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長，提示紅景天苷可明顯改善VD大鼠空間認(rèn)知功能的損害。

氧化應(yīng)激是與腦卒中相關(guān)的神經(jīng)損傷和認(rèn)知功能障礙的調(diào)節(jié)劑，在大鼠腦梗死灶周圍出現(xiàn)氧化DNA損傷[11-13]。氧化應(yīng)激不僅與VD有關(guān)，而且與VD的所有危險(xiǎn)因素均有關(guān)。MDA、SOD在很多研究中被廣泛地用來代表氧化應(yīng)激能力的水平[14-15]。在氧化損傷過程中，MDA水平增加被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化作用的一個(gè)特殊標(biāo)志[16]。此外，氧化應(yīng)激損傷可能會(huì)導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)的損傷，如SOD活性降低。研究發(fā)現(xiàn)VD患者較阿爾茨海默病患者顯示出更高水平的MDA[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VD大鼠海馬MDA水平升高、SOD活性降低，說明VD大鼠模型出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，這與之前的研究結(jié)果一致。紅景天苷治療后MDA水平和SOD活性發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，證實(shí)了紅景天苷治療改善VD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能可能與其抗氧化應(yīng)激損傷作用密切相關(guān)。

近年研究表明，異常的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在卒中后的認(rèn)知功能損傷中扮演著重要的角色。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可能會(huì)損害大鼠缺氧后突觸傳遞的恢復(fù)過程。TNF-α是一種促炎性細(xì)胞因子，主要由激活的噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生[19]。TNF-α是在激活宿主先天防御時(shí)首先產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，上皮和內(nèi)皮細(xì)胞是其主要靶點(diǎn)[20]。TNF-α對(duì)目標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)生多重影響，包括刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生和釋放多種炎性細(xì)胞因子[21]。有研究報(bào)道TNF-α與精神分裂癥患者的認(rèn)知功能同樣也存在密切聯(lián)系[22]。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，與宿主的先天防御和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在多種炎癥條件下，IL-6水平均會(huì)發(fā)生變化[23]。TNF-α、IL-6等促炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為與阿爾茨海默病和VD的發(fā)病機(jī)制息息相關(guān)[24]。Sudduth等[25]通過引發(fā)大腦神經(jīng)炎癥，升高動(dòng)物大腦中TNF-α、IL-6水平可成功誘導(dǎo)出高同型半胱氨酸血癥相關(guān)的VD模型。本實(shí)驗(yàn)觀察到VD大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均升高，紅景天苷治療后大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均降低，提示紅景天苷治療對(duì)VD大鼠具有明顯的抗炎特性。

綜上所述，紅景天苷治療可明顯改善VD大鼠認(rèn)知功能，降低MDA水平，升高SOD活性，抑制了VD大鼠海馬促炎性細(xì)胞因子TNF-α及IL-6的表達(dá)，其對(duì)VD大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能與抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷作用密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了紅景天苷治療對(duì)VD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，這為VD或其他類型癡呆的基礎(chǔ)和臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅景天苷治療未使VD大鼠的認(rèn)知功能得到完全改善，也顯示了其治療的一定局限性，在今后的實(shí)驗(yàn)中我們將會(huì)對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步深入研究。