組蛋白去乙酰化酶抑制劑在膿毒癥及急性肺損傷中的作用研究進展

凌 濤，謝 佳，孫大勇※，錢克儉

(1.深圳市龍崗中心醫院急診科，廣東 深圳 518116； 2.南昌大學第一附屬醫院重癥醫學科，南昌 330006)

膿毒癥指感染所致宿主反應失調，進而導致危及生命的器官功能障礙[1-2]。炎癥和免疫反應失衡導致微生物生長失控，進而發生致命性炎癥反應，出現組織損傷和器官功能障礙。肺是膿毒癥最常累及的靶器官，常導致急性肺損傷等肺功能障礙[3]。因此，避免或減輕膿毒癥所致急性肺損傷是降低膿毒癥死亡率的關鍵。抗細胞因子治療膿毒癥的基礎實驗研究中取得了較好的研究結果，但對臨床膿毒癥患者生存率的影響并不大。最近，重組人活化蛋白C已經從市場撤出，此外，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)拮抗劑的療效研究也未能達到第三階段試驗的主要終點。可見，阻斷單一炎癥介質不足以阻斷炎性級聯放大反應。目前，膿毒癥治療在抗菌治療和器官支持治療方面取得了較大進展，但患者預后仍不佳。據統計，全世界每年膿毒癥患病人數超過1 900萬，其中有600萬患者死亡，病死率超過25%，已成為良性疾病的主要死因之一[4-5]。因此，迫切需要尋找有效的炎癥反應上游靶點，以抑制炎癥的“瀑布反應”。

組蛋白乙酰化修飾是生理和病理條件下基因表達的重要調節機制之一，對炎癥反應和宿主防御反應的影響較大。組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)共同催化調節組蛋白的乙酰化狀態，并通過靶向非組蛋白轉錄調節因子影響基因表達。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是干擾HDACs功能的一類化合物，通過增加細胞內組蛋白的乙酰化程度調控基因轉錄，在惡性腫瘤和慢性炎癥性疾病等的治療中發揮治療作用。在膿毒癥及其相關肺損傷中，HDACIs可發揮抑制炎癥反應和組織器官保護等多重作用。現就HDACIs在膿毒癥及急性肺損傷中的作用研究進展予以綜述。

1 組蛋白乙酰化的概述

染色質的基本單位是核小體，由四組核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4構成的八聚體及其周圍包裹的147個DNA堿基對組成。核心組蛋白的氨基端尾在核小體突起，并且受到甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等調節和修飾。HATs和HDACs分別對組蛋白的N端氨基酸殘基進行乙酰化和去乙酰化調節。HATs將乙酰輔酶A的乙酰基轉移到組蛋白尾部，并可中和組蛋白的正電荷，弱化組蛋白與帶負電荷DNA的結合，導致染色質結構疏松，有利于基因轉錄的進行。而HDACs可使組蛋白去乙酰化，促使組蛋白與DNA緊密結合，導致染色質結構致密，從而抑制基因轉錄。由此可見，核心組蛋白的乙酰化修飾是非常重要的基因表達調控機制。組蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡失調使基因表達調控紊亂，導致腫瘤發生，因此，HDACs成為抗腫瘤藥物研究的熱門靶點之一。

HDACIs可引起乙酰化核小體組蛋白堆積，抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞分化和(或)凋亡。大量臨床試驗證實，HDACIs具有良好的抗腫瘤作用，且毒副反應輕微。通常將HDACIs分為NAD+依賴性酶和Zn2+依賴性酶兩大類，Zn2+依賴性酶包括HDACsⅠ、Ⅱ、Ⅳ亞族；NAD+依賴性酶主要是HDACsⅢ亞族。大多數HDACIs為廣譜抑制劑，但是每種HDACI對不同HDAC的抑制活性不同。目前，對Zn2+依賴HDACIs的研究較多，其中曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是首個被確認的天然來源的特異性HDACI[6]。美國食品藥品管理局已批準辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)用于治療臨床晚期和難治性皮膚T細胞淋巴瘤[7]。研究發現，炎癥反應相關轉錄因子、細胞內信號分子、細胞因子受體等均受到乙酰化調節，可見HDACIs可影響炎癥性疾病的發生發展[8]。HDACIs作用機制的相關研究為膿毒癥的治療提供了新的路徑。

2 HDACIs在膿毒癥中的應用

近年來，對HDACIs在腫瘤治療中作用的研究較多。Leoni等[9]首次對膿毒癥中HDACIs作用的研究發現，SAHA可顯著降低脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導小鼠外周血單核細胞釋放的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-12、α干擾素的水平，并可降低血液中細胞因子的水平。隨后，對動物實驗模型的研究發現，HDACIs可改善系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、多發性硬化、移植物抗宿主病、哮喘、結腸炎和重癥胰腺炎等炎癥性疾病的結局[10-11]。Li等[12]對腹腔注射LPS誘導膿毒癥休克小鼠的研究發現，SAHA干預1周后，小鼠存活率較對照組(非干預組)顯著提高。Zhao等[13]對盲腸結扎穿孔(cecal ligation perforation，CLP)誘導的致命性感染性休克模型小鼠的研究發現，SAHA預處理可明顯提高小鼠的存活率，減少“細胞因子風暴”，并減輕遠處器官損傷。TSA能顯著降低小鼠骨髓巨噬細胞中促炎因子的信使RNA和蛋白質表達水平[14]。在LPS刺激血管內皮細胞后，可上調TLR4及HDAC2的蛋白表達，而TSA干預可下調LPS刺激內皮細胞后的TLR4表達[15]。

HDACIs不僅能抑制膿毒癥中過度的炎癥反應，還能發揮組織器官保護作用。Zhang等[16]對CLP誘導的膿毒癥小鼠模型的研究發現，與未經HDACIs預處理對照組小鼠相比，TSA組和丁酸鈉組小鼠肺組織的中性粒細胞浸潤減少，細胞間黏附分子-1和E-選擇素的表達顯著降低，血漿IL-6水平降低，膿毒癥所致肺損傷明顯減輕，CLP小鼠的存活時間顯著延長。在CLP誘導膿毒癥小鼠中，TSA能降低肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平，對膿毒癥急性肺損傷具有保護作用[17]。Cetinkaya等[18]對新生高氧肺損傷模型大鼠的研究發現，丙戊酸鈉治療可改善肺損傷，減少促炎細胞因子及脂質過氧化生物標志物的表達，增強抗氧化酶活性。使用SAHA立即處理LPS誘導膿毒癥小鼠發現，SAHA可逆轉LPS誘導的抗氧化酶谷胱甘肽的減少，減輕LPS誘導的肝細胞凋亡，并有效改善膿毒癥繼發的急性肝損傷[19]。由此可見，HDACIs可抑制過度炎癥反應，提高組織細胞存活能力，在膿毒癥治療中可能發揮重要作用。

3 HDACIs在膿毒癥治療中的作用機制

目前認為，HDACIs本質上是固有免疫細胞關鍵免疫受體表達和抗菌作用的負性調節因子，可降低巨噬細胞對細菌的吞噬和殺傷作用，提高機體對非嚴重感染的易感性。當機體發生膿毒癥和膿毒癥休克等嚴重感染時，HDACIs可保護組織細胞免受致命性的炎癥損傷。HDACIs對膿毒癥及相關肺損傷的保護作用可能通過以下途徑實現。

3.1抑制TLR4-髓樣細胞分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)-核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路 TLR4是一種跨膜蛋白，具有識別病原微生物、激活天然免疫系統、介導炎癥反應等重要生物學功能。TLR4的結構包括胞外域、跨膜區和胞內域，TLR4胞外域識別LPS后，其構象發生變化，將信號轉導至胞內域，TLR4胞內域與MyD88 C端結合，同時MyD88的N端與IL-1受體相關激酶的N端結合，激活IL-1受體相關激酶，通過TNF受體相關因子6和轉化生長因子激活激酶1，進而級聯激活下游的NF-κB和MAPK信號轉導途徑。

NF-κB廣泛存在于細胞的蛋白質復合物中，具有多向性DNA轉錄調節作用，可促進細胞因子產生。在靜息狀態下，NF-κB的兩個亞單位p65、p50在細胞質以失活狀態存在，當上游信號(通常為MyD88介導的TLR4/NF-κB信號通路)激活后，使p65、p50活化，轉移到細胞核內，以p65亞單位為著，并與相應炎癥基因結合。與炎癥反應關系較密切的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥介質的基因啟動子上均有NF-κB的結合位點，NF-κB與其結合后，可增強基因的轉錄和表達，促使炎癥介質大量釋放，從而導致組織細胞的炎性損傷。與非轉基因技術構建的胰腺炎模型小鼠相比，雨蛙素誘導的轉基因技術增強NF-κB表達急性胰腺炎小鼠模型的NF-κB激活水平升高，且IL-1β、IL-6、TNF-α的表達明顯上調，胰腺炎加重[20]。將高選擇性HDAC6抑制劑Tubastatin應用于LPS刺激的原代乳腺上皮細胞后，TNF-α和IL-1β等促炎細胞因子的釋放顯著降低，可能與HDAC6抑制導致NF-κB信號轉導途徑抑制有關[21]。在NF-κB轉錄活性的調控中，p65的乙酰化起到關鍵作用，p65的乙酰化可降低p65與DNA的結合，并促進其移出細胞核，從而抑制NF-κB活性[22]。

MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可將信號從細胞外轉導到細胞核內部，并可介導細胞的生長、發育、分裂、炎癥反應及其對環境的應激適應等多種細胞生理過程。MAPKs家族包括胞外信號調節激酶、c-Jun氨基端激酶、p38激酶等亞族，LPS可激活以上多條通路，使效應細胞分泌炎癥因子。研究發現，p38 MAPK抑制劑可降低急性胰腺炎動物模型肺組織的中性粒細胞趨化因子和髓過氧化物酶的水平，減輕肺組織病理損傷[23]。Kim等[24]發現，HDACIs可提高CLP誘導膿毒癥小鼠的存活率，減輕器官損傷，并降低血清TNF-α和IL-6水平，降低TLR4、磷酸化蛋白激酶p38、磷酸化c-Jun氨基端激酶和磷酸化胞外信號調節激酶蛋白的表達。MAPK磷酸酶-1是受乙酰化調節的MAPK通路負性調節因子，HDACIs可增強其對MAPK信號通路的負性調節作用，使MAPK失活，抑制下游炎癥相關因子的表達。可見，NF-κB和MAPK活性均受到乙酰化的調節，HDACIs可通過抑制TLR4-MyD88-NF-κB/MAPK信號通道發揮抗炎作用。

3.2調控微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一類內源性非編碼小RNA，長度為19～25個核苷酸，與靶基因信使RNA結合可促進其降解或阻止靶基因翻譯，從而抑制靶基因表達[25]。部分miRNA在炎癥反應中發揮著重要的調控作用[26]。目前研究較多的與促炎或抑炎作用相關的miRNA主要有miR-155、miR-146a、miR-132、miR-142、miR-302b等。與健康人群相比，膿毒癥患者miR-155 水平顯著升高，且miR-155水平與膿毒癥嚴重程度呈正相關，高水平miR-155可誘導CD39+調節性T細胞的增殖，加重免疫抑制，加劇膿毒癥免疫失衡[27]。Taganov等[28]發現，LPS刺激可誘導人單核細胞miR-146a的分泌增加，從而抑制炎癥反應，其作用可能是miR-146a抑制IL-1受體相關激酶1和TNF受體相關因子6，進而抑制了NF-κB活性。對人體炎癥反應過程中miRNA變化的研究發現，miR-146a與炎癥反應密切相關，可用于感染與非感染全身炎癥反應的鑒別[29]。研究證實，miR-146a參與了LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應的調節[30]。Liu等[31]研究發現，LPS刺激肺泡巨噬細胞后，miR-132的表達上調，可見miR-132可能通過增強膽堿能抗炎途徑抑制LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥。將miR-142激動劑預注射至CLP誘導膿毒癥小鼠模型的研究發現，小鼠體內炎癥反應減弱，IL-2和TNF-α分泌減少，且外周血CD4+T/CD8+T細胞比例顯著提高；但若經CLP處理后立即給予miR-142激動劑，則上述作用消失，推測miR-142可能通過調節免疫微環境抑制CLP誘導的炎癥反應[32]。

HDACIs與miRNA關系密切。Scott等[33]采用微陣列分析法觀察HDACIs刺激乳腺癌細胞miRNAs表達變化的研究發現，HDACIs刺激后5個miRNA表達上調，22個miRNA表達下調，提示HDACIs可影響miRNA的表達。Jiang等[34]研究顯示，TSA可通過提高衰老小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB與miR-146a啟動子的結合使miR-146a的表達顯著提高，進而減輕LPS誘導的炎癥反應。Wang等[35]對骨關節炎成纖維樣滑膜細胞的研究發現，HDACIs可顯著提高miR-146a的表達，從而負向調節IL-1。因此，HDACIs可能通過miRNAs發揮其抗炎作用。

3.3抑制肺泡上皮細胞凋亡 肺泡上皮細胞凋亡是膿毒癥肺損傷過程中肺泡細胞死亡的主要機制之一。細胞色素C是由線粒體釋放的促凋亡蛋白，正常情況下存在于線粒體和細胞核內部，LPS刺激后，細胞色素C從線粒體內釋放至胞質，激活胱天蛋白酶3，導致DNA上核酸酶切位點暴露，從而加速了氧自由基和核酸內切酶的破壞，最終導致DNA片段化，出現細胞凋亡。陳隆望等[17]研究發現，TSA可抑制膿毒癥肺組織中凋亡相關蛋白細胞色素C、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9的表達，表明TSA可通過線粒體途徑減輕膿毒癥肺組織凋亡。Takebe等[36]研究也發現，CLP誘導敗血癥小鼠肺組織中HDAC1、HDAC2、HDAC3蛋白的水平降低，組蛋白H3、H4的乙酰化水平增高，廣譜HDACIs干預可顯著抑制肺和脾臟的細胞凋亡。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路在細胞存活和凋亡中起重要作用。對大鼠失血性休克模型的研究發現，HDACI可提高腎細胞蛋白激酶B的磷酸化水平，下調凋亡蛋白Bad蛋白的表達，表明HDACI可通過蛋白激酶B途徑保護失血性休克大鼠腎細胞[37]。張力蛋白同源基因蛋白是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路的主要抑制性調節因子，HDACIs使張力蛋白同源基因蛋白過乙酰化，減弱其抑制作用，使蛋白激酶B活性增加，從而抑制細胞凋亡。

4 小 結

膿毒癥致病因素復雜、感染部位不易明確、致病病原體類型繁多，導致治療難度大，對人類健康構成巨大威脅。炎癥和免疫反應失衡是膿毒癥發生發展的主要機制，目前尚缺乏針對膿毒癥發病機制的特異性藥物，膿毒癥治療仍以抗感染為主。但是目前的研究結果表明，HDACIs可在基因轉錄水平對膿毒癥發生發展過程中的炎癥因子、炎癥信號通道等進行調控，有望成為治療膿毒癥的新藥物，其作用機制可能包括：①抑制TLR4-MyD88-NF-κB/MAPK信號通道，減少炎癥因子的釋放；②調控miRNAs轉錄水平，調節靶基因表達，抑制炎癥介質產生；③抑制肺泡上皮細胞凋亡等。目前HDACIs在膿毒癥治療方面的研究尚處于起步階段，相關研究多為細胞或動物實驗，有效劑量能否安全用于人類尚不清楚。此外，目前應用的HDACIs多為廣譜抑制劑，其作用機制較復雜，所致不良反應的程度尚不明確，故仍需進一步的研究。