DNA甲基化修飾在惡性胸腔積液診斷中的研究進展

朱 葉，史家欣，李家樹

(徐州醫科大學附屬連云港醫院呼吸與危重癥醫學科，江蘇 連云港222000)

惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)是指原發于胸膜的惡性腫瘤或其他部位的惡性腫瘤轉移至胸膜引起的胸腔積液。確定MPE診斷的“金標準”是在胸腔積液細胞沉淀中找到惡性細胞[1]。幾乎所有類型的腫瘤都可能發生胸膜受累，在所有的滲出性胸腔積液中MPE病死率居第二位，僅次于肺炎旁積液[2]。無論是代表真正的腫瘤侵犯還是疾病的間接影響(惡變性胸腔積液)，MPE均提示惡性腫瘤臨床分期進入Ⅳ期，排除了治愈性治療方法的可能[3]，因此一旦確診，原發腫瘤部位的中位生存期為4～7個月，1年生存率為23%，2年生存率為7%，預后極差[4]。據調查，美國每天約有12.5萬人因為MPE而住院，預估花費超過50億美元[2]。隨著腫瘤治療手段的不斷發展和人口的老齡化，預計MPE發病率會逐年增加，帶來快速增長的醫療保健負擔。雖然細胞學仍然是胸腔積液的主要診斷工具，但陽性率較差，特別是當腫瘤細胞不豐富時，可能會被胸腔積液中的反應性間皮細胞混淆[5]。因此，早期、準確診斷積液的性質，是一個關鍵的臨床問題。隨著MPE的形成機制被不斷修訂和完善，人們認為這可能依賴于特定且不同的轉錄程序[6]。現就DNA甲基化在MPE診斷中的研究進展予以綜述。

1 DNA甲基化

20世紀80年代后期，在分子生物學空前發展的形勢下，學科間的交叉會聚越來越明顯，1975年，英國分子生物學家對表觀遺傳學進行了系統表述，即基因的核苷酸序列不變的前提下，研究導致基因表達出現差異的可遺傳的調控方式[7-9]。對基因組而言，不僅僅是序列包含遺傳信息，而且基因組的修飾也可以記載遺傳信息[10]。主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA編輯、染色質重塑等。這些表觀遺傳修飾通過調節基因表達來確定每個細胞的身份，影響細胞因子的表達和轉錄因子的結合，進而影響免疫細胞(T細胞譜、B細胞等)的功能及免疫反應，維持機體內環境穩定[11-12]。近年研究發現，80%的疾病、腫瘤與表觀遺傳學相關，分析腫瘤標本或體液中單個基因的表觀遺傳變化和基因特征，對于腫瘤的分子亞分類、預后、對治療的反應預測以及治療后患者的隨訪都有幫助[9]。

DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶的反應[13]。DNA甲基化主要發生在-C-磷酸-G-(CpG)位點。CpG位點中，胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)毗鄰并以線性方式連接。哺乳動物60%～90%的CpG處于甲基化狀態[14]，未甲基化的CpG通常成簇分布并形成CpG島，CpG島經常存在于許多基因的5′調控區，特別是啟動子區。目前發現，腫瘤細胞基因啟動子區域高含量的5-甲基胞嘧啶可造成基因轉錄沉默，繼而抑制下游基因產物表達，導致細胞功能異常，從而使細胞癌變風險增加[15]。因此，CpG島的甲基化修飾一直是研究的重點。

2 DNA甲基化與腫瘤

DNA甲基化是表觀遺傳學水平基因表達、細胞發育和細胞分化等過程調控的重要方式。異常的甲基化表現在癌癥發生過程中有重要作用，可作為一種標記來區分癌細胞和非癌細胞[13]。2018年6月，美國臨床腫瘤學會年會上宣布了關于肺癌早期診斷的最新成果，表明在98%的特異度標準下，甲基化差異能成功檢出41%的早期肺癌(Ⅰ～ⅢA期)及89%的晚期肺癌(ⅢB～Ⅳ期)[16]。甲基化程度改變一般發生在腫瘤產生之前，隨腫瘤的發展，該變化是可逆的。一項測定空氣污染對肺癌影響的研究表明，大鼠肺組織中的特定基因在長期接受污染暴露后產生高甲基化，當機體適應污染后，甲基化的變化可以通過系統反應來調節，從而恢復正常水平[17]。另外，還有研究表明，DNA甲基化異常與腫瘤的復發、預后及評估組織間風險等方面也存在一定的聯系[18-20]。同時，甲基化研究技術不斷得到發展，特異位點甲基化研究技術主要包括甲基化特異聚合酶鏈反應、熒光定量法、亞硫酸氫鹽處理后測序、高分辨率熔解曲線、聯合亞硫酸氫鈉的限制性內切酶分析法、焦磷酸測序等[21]，這些技術的發展為研究者們提供了充分的技術支持，使腫瘤的診斷更為方便、快捷。更令人震驚的是，2016年，研究人員根據2790個起源已知的腫瘤樣本(這些樣本代表了38類腫瘤，包括85個轉移病例)，建立了基于微陣列DNA甲基化標簽的癌癥分類方法，并將之稱為微陣列DNA甲基化標記，成為首個用于診斷腫瘤起源的表觀遺傳學檢測方法，使醫師能夠根據腫瘤類型來制訂更具體的治療方案[22]。基于上述研究背景，研究者們逐步探討甲基化譜在鑒別惡性和良性胸腔積液中的診斷價值，檢查血清和胸腔積液樣本中甲基化的一致性[23]。

3 DNA甲基化在非小細胞肺癌相關的MPE中的診斷

MPE多繼發于其他部位腫瘤的胸膜轉移，臨床上以肺癌為主，最常見的組織學類型為腺癌[24]。研究表明，在首次使用侵入性程序分析(胸腔穿刺、經皮肺穿刺活檢、支氣管鏡活檢等)的大約50%的疑似肺癌患者中診斷不能得到確認[25-27]。因此，為了避免重復穿刺或支氣管鏡檢查，需要更有效的方法輔助確診，針對胸腔積液的表觀遺傳研究對MPE的早期診斷尤其重要。

Wnt基因編碼的Wnt分泌蛋白家族，通過與細胞表面不同的受體結合，與控制生長的喪失和細胞分化的損害有關，大多數細胞信號轉導途徑存在細胞外拮抗劑，作為對細胞生長分化的調控[28]。其中，拮抗劑重組人Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor 1，WIF-1)能夠與Wnt蛋白結合并抑制Wnt蛋白的活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖分化[29]。在75%～83%的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中發現，WIF-1啟動子區域呈高甲基化狀態，下調WIF-1而異常激活Wnt通路[30]。后來人們發現，WIF-1中存在5個表皮生長因子樣域[31]。既往大量研究證實，表皮生長因子受體信號轉導可促進腫瘤血管生成與血管滲漏[32]。由此推斷，WIF-1對MPE的形成具有一定意義。Yang等[33]運用甲基化特異聚合酶鏈反應技術對WIF-1啟動子甲基化異常用于診斷NSCLC相關MPE的診斷價值做出了分析，靈敏度為69.4%，特異度為100%，提示WIF-1啟動子區域在胸腔積液細胞中的高甲基化可以作為NSCLC相關MPE的輔助診斷標志物。

抑癌基因p16是一種細胞周期中的基本基因，直接參與細胞周期的調控，負調節細胞增殖及分裂。p16基因編碼產物是分子量為16 000的蛋白，即p16蛋白，定位于細胞核內，p16蛋白是作用于細胞分裂周期關鍵酶之一的周期蛋白依賴性激酶4的抑制因子，p16基因的表達一旦失靈則會導致細胞惡性增殖，導致惡性腫瘤的發生[34]，因此常將p16基因比作細胞周期中的剎車裝置[35]。曾有研究表明，在Ⅰ/Ⅱ期肺癌患者中，p16甲基化與整體生存率密切相關[36]。劉大鷹等[37]證實了在肺腺癌相關的MPE中p16基因甲基化的診斷價值，靈敏度為69.4%，特異度為86.7%，準確率為77.3%，并表明p16基因的甲基化狀態與腫瘤的組織細胞類型及分化程度無關，進一步表明了p16基因甲基化是肺癌發生發展中的早期事件。由于病例數量有限，劉大鷹等[37]的結果存在一定的爭議。2013年一項薈萃分析證實，在胸腔積液中，p16甲基化檢測在MPE的診斷中發揮著重要作用，靈敏度41%，特異度97%[38]。

人矮小同源盒基因SHOX2(short stature homobox 2)是同源盒基因家族的一員，位于X染色體短臂22.33(Xp22.33)和Y染色體短臂11.3位置(Yp11.3)，因最初被發現與一系列生長發育遲緩和身材矮小的疾病有關而得名，主要作用是編碼蛋白轉錄因子[39]。研究表明，SHOX2基因表達調控對骨骼、心臟和神經系統的發育起到重要作用[40]。SHOX2基因有2個較大的CpG島，1個在基因的5′端覆蓋約1 kb的區域，另1個在3′端覆蓋約0.5 kb的區域[41]。以肺癌組織或細胞為對象的甲基化研究均發現SHOX2基因CpG島的甲基化水平比正常組織或細胞顯著升高，即超甲基化現象[42-45]。推測由于SHOX2基因編碼蛋白轉錄因子，其基因的超甲基化對下游基因產物表達有很大影響，所以SHOX2基因超甲基化有可能影響多個蛋白的表達，從而促使細胞癌變。Ilse等[46]在胸腔積液標本中發現SHOX2基因的高甲基化是診斷MPE的高度特異性生物標志物(特異度96.2%，靈敏度39.5%)，結果提示更側重于MPE的確診，而非篩選。栗少飛和聶立功[47]在60例胸腔積液中進行研究，得出的結論與Ilse等[46]的結果(靈敏度35.7%，特異度100%)一致。一項薈萃分析表明，在NSCLC相關的MPE中，SHOX2甲基化較傳統的生物標志物(癌胚抗原、細胞角蛋白19片段抗原21-1、鱗狀細胞癌抗原和神經元特異性烯醇化酶等[48])，具有更高的靈敏度(70%)和特異度(96%)[42]。

O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一種DNA修復蛋白，MGMT通過啟動子甲基化沉默，導致MGMT蛋白低表達，可降低DNA修復活性[49]。此前，MGMT啟動子甲基化被證實與肺癌p53基因G:C向A:T轉化突變有關，在非吸煙者肺腺癌中比在吸煙者中更常見，并與腫瘤進展有關(晚期較早期更普遍)[50]。由此推測，MGMT甲基化檢測可能是一種有前途的非/微創檢測方法，在腫瘤組織難以獲取患者的臨床治療中具有特殊的應用價值。Katayama等[51]試驗發現，在81例胸腔積液患者(惡性47例、非惡性37例)中，MGMT甲基化未出現在非MPE中，推測MGMT基因甲基化可能是區別良惡性胸腔積液的生物學標志物。但由于樣本量較少，仍需大量實驗論證。

基于單基因的研究發現，單個表觀遺傳標志物診斷MPE具有極高的特異性，但靈敏度似乎不夠理想[51]。因此猜測，一種以上基因同時甲基化的頻率可能為檢測提供一種更為敏感的方法。Botana-Rial等[52]使用甲基化特異聚合酶鏈反應技術檢測胸腔積液中腫瘤抑制基因p16、MGMT、乳腺癌1號基因和視黃醇受體β的甲基化水平，使用受試者操作特征曲線評估用于區分惡性和良性胸腔積液的各基因的準確性；采用單變量和多變量Logistic回歸分析，檢測各基因甲基化水平與MPE之間的關系，結果在83.3%的MPE患者中檢測到至少一種基因的高甲基化。一項關于不同類型腫瘤導致的MPE中8種基因甲基化(視黃醇受體β、腺瘤樣結腸息肉易感基因、乳腺癌1號基因、MGMT、視黃醇結合蛋白1、脆性組氨酸三聯體、Ras相關區域家族1基因、p16)的前瞻性隊列研究表明，單獨細胞學診斷MPE的靈敏度為63%，單獨甲基化的靈敏度為67%，兩者的特異度均為100%，兩者結合分析可將MPE的診斷靈敏度提高至88%，表明胸腔積液的甲基化檢測可與細胞學產生互補作用，提高MPE的診斷率[53]。上述研究均提示胸腔積液中DNA的異常甲基化可能是MPE的一種有價值的診斷標志物。

4 DNA甲基化在惡性間皮瘤相關MPE中的診斷

惡性間皮瘤是與胸腔積液相關的最常見的原發性胸膜惡性腫瘤，患者中80%～95%在診斷時有大量胸腔積液[54]。但臨床上間皮瘤較少見，因此常會發生漏診。Fujii等[55]采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測了不同肺部疾病患者胸腔積液中特定DNA的甲基化狀態，包括惡性間皮瘤、肺癌和良性的石棉胸膜炎，結果表明，胸腔積液DNA中腫瘤抑制基因 Ras相關區域家族1基因、p16、視黃醇受體β異常啟動子高甲基化的鑒定可能是鑒別惡性間皮瘤與肺癌的一個有價值的標志物，在這3個基因中至少有1個基因甲基化的水平下，肺癌與惡性間皮瘤的區分靈敏度為67.4%，特異度和陽性預測值分別為79.5%和79.5%，證明了甲基化譜在胸腔積液DNA鑒別診斷惡性間皮瘤與肺癌的有效性。

5 小 結

DNA甲基化是轉錄和調控控制的重要表觀遺傳學改變，是表觀基因組領域最有前途的生物標志物，它提供了一種強大的工具，可以根據直接從腫瘤或“偏遠”位置(如痰、胸腔積液或血清)獲得的遺傳物質進行診斷，特別是當細胞數量有限時，可擴增的DNA標記可以為癌癥檢測和分類提供非常敏感的工具[56]。因此，胸腔積液DNA中異常的甲基化狀態可能是MPE有價值的診斷標志物。然而，在臨床實際工作中，甲基化檢測技術仍有引物設計較難、試劑價格昂貴等問題，因此還未廣泛推廣于臨床應用，多見于科研研究。但胸腔積液的甲基化分析是一種很有前途的、適合臨床應用的工具，有必要進行進一步研究以尋找每種疾病特異性甲基化的基因或基因組合。