慢性粒細胞白血病伊馬替尼耐藥治療新進展

于冬旭，高玉娟，楊立瑩，楊東光

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院a.血液內科，b.中心血液實驗室，哈爾濱 150001)

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種常見的造血系統惡性腫瘤，主要表現為骨髓中髓樣細胞的增多和不受控制的生長及其在血液中的積聚。CML的標志是費城染色體，其由染色體9和22長臂之間的相互易位產生，該染色體易位導致Bcr-Abl表達，Bcr-Abl是具有組成型活化的Abl酪氨酸激酶的原癌融合蛋白。其通過激活下游信號蛋白促進白血病的發生，從而增加細胞的存活和增殖[1]。這些信號蛋白包括RAS/促分裂原活化的蛋白激酶激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子[2]等。以伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)為代表的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)是治療CML的一線藥物，該藥能特異性阻斷ATP在Abl激酶上的結合位置，使酪氨酸殘基不能磷酸化，從而抑制Bcr-Abl陽性細胞的增殖，相對于干擾素、白消安、羥基脲等傳統治療藥物，IM可顯著提高CML治療效率及早期患者的生存率，但該藥物并不能治愈CML，且可能出現IM的耐藥，對晚期CML患者IM療效欠佳，不能阻止疾病的復發和進展[3]。IM的耐藥機制復雜，按是否與Bcr-Abl相關可分為Bcr-Abl依賴性或Bcr-Abl非依賴性[4]。現就CML IM耐藥機制及新治療進展予以綜述。

1 IM耐藥機制

1.1Bcr-Abl依賴性耐藥機制 Bcr-Abl依賴性耐藥機制主要包括Bcr-Abl基因點突變、Bcr-Abl融合基因的擴增、Bcr-Abl蛋白的過表達等，其中Bcr-Abl激酶結構域發生點突變是最常見的耐藥原因[5]，而T315I突變是最頑固的點突變，占Bcr-Abl激酶結構域點突變的15%[6]。IM主要作用于Bcr-Abl融合基因區域，若其作用位點發生突變，則藥物將不能與其結合從而導致下游異常信號轉導，臨床表現為腫瘤細胞的繼續增生克隆，因而產生耐藥[7]。同時，Bcr-Abl基因中的突變能干擾Bcr-Abl的激酶結構域與抑制劑分子之間形成的關鍵氫鍵，削弱Bcr-Abl蛋白結合抑制劑分子ATP結合位點的能力。最常見的Bcr-Abl激酶區突變主要為以下4個簇區發生突變：P-環簇、T315近側簇、酶促反應簇和A-環簇，其中P-環和T315I的突變作用最強且最常見，可完全阻斷IM與ATP的結合[8]。除Bcr-Abl激酶突變外，Bcr-Abl融合基因的擴增和蛋白的過度表達也是導致IM耐藥的常見原因，其可使原有劑量的IM不足以控制病情，從而導致耐藥的發生。

1.2Bcr-Abl非依賴性IM耐藥機制

1.2.1白血病干細胞(leukemia stem cells，LSCs)的存在 CML-LSCs或稱白血病起始細胞是所有CML細胞的共同祖先。LSCs的一些生長特性決定了其對TKIs的治療具有抵抗作用。①雖然Bcr-Abl蛋白賦予了CML-LSCs白血病的特征，但Bcr-Abl并非CML-LSCs賴以生存的唯一蛋白。在IM的作用下，CML-LSCs還可以通過其他信號維持存活。研究證實，盡管IM對CML患者靜止期和循環中干、祖細胞的Bcr-Abl蛋白活性具有抑制作用，卻無法清除CML-LSCs[9]。②CML-LSCs具有遺傳不穩定性，隨著對CML治療的深入研究發現，CML-LSCs逐漸產生基因突變，形成CML的克隆演變，對現有治療方法產生抵抗[10]。雖然TKIs持續作用，但CML-LSCs仍可以維持存活狀態，并隨著克隆演變最終失控生長，這是CML發生非Bcr-Abl依賴式耐藥的根本原因[11]。因此，清除對治療不敏感的CML-LSCs，是治療 IM耐藥的關鍵[12]。

截至目前，研究者已發現多種CML-LSCs賴以生存的信號通路及其相應的靶向性藥物。這些信號通路主要包括Bcr-Abl/PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路、Hh(Hedgehog)通路、Wnt通路、Bcl-6/p53通路等。研究發現，PI3K/Akt/mTOR通路經常在許多人類癌癥中被激活，PIK3CA突變和人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因功能喪失可導致對靶向PI3K/Akt/mTOR信號轉導途徑治療的敏感性增加；同時該研究還發現，PI3K/Akt/mTOR通路與IM耐藥相關[13]。因此，鑒定靶向抑制劑可以為CML治療提供新策略。

Hh信號轉導途徑是進化上的保守途徑，其在調節涉及正常干細胞分化和增殖以及無脊椎動物和脊椎動物中適當分離的各種發育和生理過程中起重要作用。然而，學者發現在胚胎發育期間Hh通路的錯誤調節會引起各種先天缺陷及幾種腫瘤轉化和惡性腫瘤[14]。此外，Hh通路在維持體細胞干細胞和多能細胞中起重要作用，它參與了肺、牙齒、肝臟、前列腺和膀胱中上皮干細胞的再生增殖，且這種信號轉導通路可能與癌癥干細胞的維持相關。因此，通過抑制Hh信號轉導通路靶向癌癥干細胞是一種可以有效改善癌癥患者臨床結果的潛在治療方法[14]。Hh通路是一條干細胞通路，但作為CML-LSCs的重要通路，Hh信號分子并不位于Bcr-Abl的下游，也不能被TKIs所抑制，提示對IM耐藥的患者，需聯合Hh靶向性抑制劑進行治療。

自從Wnt信號通路被發現以后，許多針對Wnt信號通路及其抑制劑在惡性腫瘤治療方面的研究取得了令人滿意的成果。Wnt信號通路分為經典的依賴β聯蛋白途徑和非經典的不依賴β聯蛋白途徑，β聯蛋白是正常造血干細胞自我更新和生存所必需，Wnt/β聯蛋白通路在CML-LSCs的持續存在中具有重要作用[15]。

Bcl-6/p53通路對腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性有調節作用。體外和體內研究表明，費城染色體陽性的急性淋巴細胞白血病細胞和IM耐藥的CML細胞均有Bcl-6蛋白的高表達；Bcl-6介導p53的上調，Bcl-6通過靶向p53誘導IM耐藥細胞的生長抑制和凋亡[16]。

此外研究發現，CML-LSCs表達的某些蛋白可作為其潛在的治療靶標，如γ聯蛋白[17]、血紅素加氧酶-1[5]、蛋白質精氨酸甲基轉移酶5[18]等與IM耐藥密切相關。

1.2.2LSC的骨髓微環境 對于白血病、淋巴瘤等惡性血液病，癌細胞與骨髓基質細胞動態相互作用，且更有可能在骨髓微環境中產生耐藥性。研究發現，骨髓微環境中的可溶性因子，如基質細胞衍生因子-1、CXC趨化因子配體12和白細胞介素-6可介導腫瘤細胞的歸巢、存活和增殖，并引起可溶性因子介導的抗藥性[16]。CXC趨化因子配體12的激活是導致白血病細胞耐藥的關鍵因素之一，其在造血干細胞歸巢過程中起重要作用，介導人和小鼠祖細胞的存活和增殖。骨髓微環境通過激活CXC趨化因子配體12/CXC趨化因子受體7通路和胞外信號調節激酶磷酸化誘導CML細胞對IM治療的抗性[19]。

1.2.3多藥轉運體和藥物靶酶的過度表達 IM的耐藥機制非常復雜，研究表明，多藥轉運體和藥物靶酶的過度表達可能與CML的IM耐藥有關[20]。其中，研究最深入的機制為由P-糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)和多藥耐藥相關蛋白-1介導的多藥耐藥。PGP由多藥耐藥基因(ATP結合盒B亞家族成員1轉運蛋白基因)編碼，并參與藥物吸收、分布、代謝和排泄。多藥轉運體，如PGP、多藥耐藥相關蛋白家族、乳腺癌耐藥蛋白等，均能促進轉運，緩解細胞內藥物外流或囊泡分離，導致細胞內藥物濃度降低或藥物分布改變。而以PGP和多藥耐藥相關蛋白-1介導的多藥耐藥為最佳研究對象[20]。

2 CML與IM耐藥治療

2.1Bcr-Abl依賴性耐藥的治療 針對不同的耐藥點突變，已靶向研發出二代、三代TKIs，它們不僅對IM耐藥的點突變分別起效，且激酶活性更高，抑制能力更強。其中，二代TKIs(尼洛替尼、達沙替尼和布素替尼)對除T315I外的一系列Bcr-Abl突變均有效。三代TKIs(扎那替尼)則可靶向性抑制含有T315I突變的Bcr-Abl陽性CML細胞。雖然Bcr-Abl單突變的CML患者對扎那替尼具有初始反應，但晚期患者對該藥的反應有限，因為連續使用TKIs會導致Bcr-Abl激酶結構域復合突變，這種突變對扎那替尼耐藥[21]。雖然新一代的TKIs可分別對各自耐藥突變起效，但也能造成患者出現TKIs多藥耐藥現象[22]。因此，耐藥患者缺乏有效的治療方案，死亡率極高。

2.2Bcr-Abl非依賴性耐藥的治療 研究發現，丙泊酚[23]及靶向表皮生長因子受體激酶底物8(epidermal growth factor receptor kinase substrate 8，EPS8)[24]可以作用于Bcr-Abl/PI3K/Akt/mTOR通路。Tan等[23]通過體內體外聯合實驗，系統研究了丙泊酚及其聯合應用對細胞系、患者細胞和小鼠模型的影響。結果發現，丙泊酚與TKIs聯合應用對CML細胞的作用具有特異性，且不影響正常細胞，故其可能成為IM治療的新選擇。EPS8被鑒定為一種致癌基因且在廣譜實體瘤中起重要作用，其與急性白血病患者的不良預后或化學抗性相關。Huang等[24]通過體外研究發現，EPS8通過Bcr-Abl/PI3K/Akt/mTOR途徑調節Bcr-Abl陽性細胞的增殖、凋亡和化學敏感性，EPS8的敲低減少了BALB/c裸鼠中的K562細胞增殖。因此，單獨靶向EPS8或與TKI組合可能是一種新治療策略。

目前，研究的Hh通路抑制劑均以Smo為靶點，包括GDC-0449、LDE225、PF-04449913及BMS-833923等，Hh通路抑制劑的藥理活性較Smo的天然抑制劑環巴胺提高。且研究發現，Hh通路抑制劑與TKIs聯合應用，在治療CML的臨床前研究中獲得了滿意療效[25]。此外在急性髓系白血病中，環巴胺能恢復LSCs對化療藥物的敏感性，提示這類藥物也可能作為逆轉耐藥藥物[26]。研究證實，三氧化二砷對Hh通路具有顯著的抑制作用，其主要是通過抑制轉錄因子Gli1和Gli2的信使RNA表達，并同時上調Hh通路抑制因子ptch的信使RNA表達發揮作用[27]。可見，三氧化二砷應用于IM耐藥的CML患者將會顯示更大的藥用價值和更廣闊的應用前景。

目前針對Wnt信號通路，沒有直接拮抗β聯蛋白的藥物，只有一些小分子Wnt通路抑制劑，如AV65、FH535、吲哚美辛等，它們可以減少β聯蛋白表達并誘導CML細胞凋亡。因此，新的Wnt信號通路抑制劑有望為CML的治療提供更多選擇。

研究發現，高三尖杉酯堿可以作用于Bcl-6/p53通路，不同細胞經高三尖杉酯堿處理后，Bcl-6的表達均有中度下調；而CML患者的Bcl-6表達水平明顯高于正常人，且Bcl-6在CML急變期患者中的表達水平明顯高于CML慢性期患者[16]。高三尖杉酯堿的抗白血病機制不同于IM，其是用于IM耐藥患者的最有效藥物之一。同時，高三尖杉酯堿是蛋白質翻譯的抑制劑，它通過影響核糖體的A位點來阻止蛋白質的合成，且可以通過阻斷Bcl-6/p53通路抑制IM抗性細胞的生長并誘導細胞凋亡，這為IM耐藥及不耐藥患者的治療提供了新選擇[16]。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑是一類抗腫瘤藥物，它通過增強組蛋白賴氨酸殘基的乙酰化作用放松組蛋白核心表面被抑制基因的轉錄，其可以選擇性殺傷惡性腫瘤，同時保留正常細胞。此外，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑與TKIs聯合應用，可消除CML和急性骨髓增生性疾病中靜止的LSCs。雖然口服組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以消除CML中的靜息LSCs，但對其殺死LSCs的潛在機制尚不清楚。Jin等[17]通過用生物素標記的探針捕獲，證實組蛋白去乙酰化酶抑制劑對γ聯蛋白的抑制作用導致CML-LSCs的消除，故γ聯蛋白可能是LSCs的新型治療靶點。Wei等[5]發現，血紅素加氧酶-1通過調節組蛋白去乙酰化酶的表達參與CML細胞中耐藥性的發展，這可能是CML治療的新靶點。Jin等[18]通過體外實驗發現，在CML細胞中Bcr-Abl和蛋白質精氨酸甲基轉移酶5之間存在正反饋環，且在人CML-LSCs中觀察到蛋白質精氨酸甲基轉移酶5的過表達。另有研究表明，組蛋白精氨酸殘基的表觀遺傳甲基化修飾是控制LSCs自我更新的調節機制，且蛋白質精氨酸甲基轉移酶5可能為LSCs的潛在治療靶標[26]。

針對基質細胞衍生因子-1、CXC趨化因子配體12和白細胞介素-6等骨髓微環境中的可溶性因子，Li等[19]研究發現，千層紙素A通過干擾CXC趨化因子配體12/CXC趨化因子受體7激活和胞外信號調節激酶磷酸化來增強IM的效應。因此，千層紙素A可能是增強IM效應和逆轉耐藥性的潛在藥物，其為IM耐藥的治療帶來新選擇。

靶向PGP逆轉癌細胞耐藥性是目前研究最廣泛的策略之一。雖然已對PGP抑制劑進行了四代研究，但由于其抑制能力不強，故沒有一種藥物應用于臨床。而NFV(Nelfinavir)可以避免這一缺點，它是一種蛋白酶抑制劑，被用于治療艾滋病，可能是一種潛在的PGP抑制劑。體外實驗數據表明，NFV通過降低細胞內ATP含量與ATP和PGP結合位點競爭以抑制K562/ADR細胞PGP的功能，其與ADR結合導致活性氧類增加，阻斷胞外信號調節激酶/Akt信號轉導途徑以增加細胞凋亡，從而逆轉多藥耐藥[28]。Germacrone是一種萜類化合物，其已被報道可逆轉乳腺癌細胞的多藥耐藥。Pan等[29]研究發現，Germacrone可通過抑制多藥耐藥1基因/PGP表達，逆轉人慢性粒細胞白血病K562/ADM細胞對阿霉素的耐藥性，提示其可能是一種新的CML化療多藥耐藥逆轉劑。

3 小 結

CML是一種起源于造血干細胞水平的惡性克隆性疾病，隨著IM的問世，大部分CML患者得到治愈，但仍有一些患者出現耐藥，且達到完全分子生物學緩解的患者，停用IM也存在復發風險。目前針對不同突變位點設計的二代和三代TKIs，雖然可以分別對各自耐藥突變起效，但也能造成患者出現TKIs多藥耐藥現象。研究發現，TKI不能清除CML-LSCs，大部分應用TKI治療的CML患者Bcr-Abl信使RNA持續存在，但其具體耐藥機制尚不明確[30]。未來，需進一步探究靶向CML-LSCs的耐藥機制，根據不同的耐藥機制研發更多新藥物，從而為治愈CML提供更多的治療選擇。