不同亞型巨噬細胞調控動脈粥樣硬化轉歸的免疫學機制探析

陳 萍 陳文娜

1.遼寧中醫藥大學研究生學院(遼寧 沈陽 110032)；2.遼寧中醫藥大學醫學檢驗學院(遼寧 沈陽 110032)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種慢性的血管炎癥，主要的病理改變是血管內膜可見脂質沉積，同時伴有單核細胞及平滑肌細胞的大量增生，單核細胞吞噬脂質后形成泡沫細胞，隨著脂質的不斷沉積和結締組織的大量增生，脂點、條紋逐漸融合成片，向內膜表面隆起形成粥樣斑塊，從而引起血管腔的狹窄。粥樣斑塊形成早期單核細胞遷移到血管內皮下層，分化為巨噬細胞，巨噬細胞在AS發病過程中發揮著重要作用，可通過調控血管炎癥、脂質沉積等影響動脈粥樣硬化的轉歸。

1 巨噬細胞的極化和可塑性

巨噬細胞的分型是根據其極化后所發揮的功能進行命名的，即以分泌促炎因子為主、發揮促炎活性的為M1型巨噬細胞；分泌抗炎因子、發揮抗炎及組織修復作用的細胞為M2型巨噬細胞[1]。干擾素-γ(interferon-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等可刺激巨噬細胞活化成為典型M1細胞。M1活化的標志物有白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、TNF-α、IL-12、IL-23、CXCL9及CXCL10等。M1型巨噬細胞可以產生大量一氧化氮(NO)、活性氧等中間產物，參與腫瘤發生及抗寄生蟲感染的免疫過程。M2型巨噬細胞由IL-4，IL-10和糖皮質激素刺激分化而成，Th2淋巴細胞產生的IL-4與巨噬細胞表面的IL-4R結合，激活下游的JAK1、JAK3細胞信號通路，最后激活STAT6，表達M2型細胞相關蛋白[2]。M2型巨噬細胞可產生大量IL-10及少量IL-12，參與組織重塑、血管發生和腫瘤發展等過程，同時作為免疫調節劑參與過敏反應。M2型巨噬細胞又分為4個亞型，分別為M2a，M2b，M2c，M2d。M2a的a代表“alternative”，M2a由IL-4、IL-13、免疫復合物、脂肪酸和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)激動劑或IL-1R配體刺激分化而來，高表達甘露糖受體MR/CD206及FoxO1，分泌大量IL-10，其次是TNF-α，IL-6和IL-1。M2c型巨噬細胞由IL-10、TGF-β、糖皮質激素等刺激產生，高表達Mer受體激酶(Mer receptor kinase，MerTK)[3]，并能分泌大量IL-10來抑制促炎細胞因子、NO、活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產生，抑制炎癥發展。M2d型巨噬細胞由TLR激動劑刺激分化而來，TLR激動劑可刺激M2d型巨噬細胞上的腺嘌呤受體A2A受體。腺嘌呤信號通路可抑制TNF-α、IL-1和IFN-γ表達，并能促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-10的表達，從而發揮促血管生成作用[4]。嚙齒動物的M2型巨噬細胞特異性標志物有FIZZ1(Found in inflammatory zone 1)、精氨酸酶(Arginase-1，Arg1)。其中M2d型巨噬細胞并不表達FIZZ1和MR。

2 巨噬細胞亞型與動脈粥樣硬化病變

體外實驗中由于刺激單一，所以產生的巨噬細胞亞型單一，但體內實驗情況復雜，斑塊中常常存在多個亞型的巨噬細胞，而且亞型的種類與其在斑塊中的位置有關。人的動脈粥樣硬化病變具有高度異質性，即根據環境等多種因素可刺激生成多種巨噬細胞亞型。目前，巨噬細胞產生不同亞型的機制及其在AS發生中的作用機制尚不明確。

研究顯示CD68+MR+的巨噬細胞主要存在于IL-4水平較高、脂質水平較低的斑塊區域。Boyle等人發現了一種新的巨噬細胞亞型，稱為HA-mac。這種亞型巨噬細胞主要存在于粥樣斑塊的出血區域，高表達CD163，低表達人白細胞抗原DR。研究發現這種亞型的巨噬細胞具有抗動脈硬化的作用，其能清除血紅蛋白，減少氧化壓力。Mhem型巨噬細胞與HA-mac型巨噬細胞的功能相似，具有破壞紅細胞的作用[5]。這種巨噬細胞能導致轉錄因子1(Transcription factor 1)磷酸化激活。轉錄因子1可增加血紅素氧化酶(Heme oxygenase，HMOX-1)的表達，啟動肝X受體α(Liver X receptorα)/ABCA1/脂蛋白-E(Apolipoprotein，ApoE)級聯，從而起到抑制泡沫細胞形成的作用。粥樣斑塊中常常存在血管新生，導致紅細胞滲漏至斑塊中，從而增加斑塊中的鐵沉積。研究發現斑塊中鐵元素沉積部位往往聚集CD68+MR+型巨噬細胞，提示了M2型巨噬細胞在鐵離子循環中的作用[6]。

研究發現除了M1型、M2型和血紅蛋白相關的巨噬細胞亞型外，還存在嚙齒動物特異性的巨噬細胞，如Mox型巨噬細胞。Mox型巨噬細胞由斑塊中積累的被氧化的磷脂刺激而來。這種亞型高表達HMOX-1[7]。采用流式細胞技術對細胞分析結果顯示低密度脂蛋白受體(Low-Density Lipoprotein(LDL)Receptor，LDLR)敲除的小鼠斑塊中的巨噬細胞以M1型為主，占總巨噬細胞數的40%，其次是Mox型，占30%，M2型占20%，說明嚙齒動物特異性的巨噬細胞是粥樣斑塊中巨噬細胞的重要組成部分。近來研究發現，人的粥樣斑塊中還存在M4型巨噬細胞，其能表達基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)7和鈣綁定蛋白S100A8。此外，M4型巨噬細胞還表達MMP12，MR，以及一些促炎因子如IL-6，TNF-α。雖然M4型巨噬細胞是受CXCL4刺激極化而來，但是M4型巨噬細胞并不表達傳統的CXCL4極化標志物血紅蛋白-結合珠蛋白清除受體CD163[8]。

3 巨噬細胞亞型與AS發生

3.1巨噬細胞亞型與炎癥相關 不同亞型巨噬細胞發揮不同的免疫效應，有的為促炎癥作用，有的為抗炎癥作用，這些不同表型的巨噬細胞都參與到AS的發生發展中。研究發現20周齡的ApoE敲除的小鼠給予低能量飲食，斑塊病變中有巨噬細胞浸潤，而且以Arg+M2亞型的巨噬細胞為主，隨著疾病的發展M2型巨噬細胞轉變為M1型。與此同時斑塊中的細胞因子種類也發生變化，開始時以IL-4為主，隨著病情的進展IFN-γ的表達增加，從而導致M2型巨噬細胞轉化為M1型巨噬細胞。Arg2+M1型巨噬細胞具有促炎癥作用，起到促進斑塊形成的作用[9]。當給予ApoE敲除小鼠髙脂飲食10周后，M-CSF高表達可刺激巨噬細胞表達M2型標志物，如selenoprotein-1，CD163等。GM-CSF刺激產生的M1型相關基因血小板堿性蛋白(Proplatelet basic protein，PPBP)主要在病變早期表達，隨著時間的延長，表達量降低。以上發現提示AS病變過程中GM-CSF和M-CSF的比例是改變的。以上說明小鼠AS病變中巨噬細胞的情況，因為小鼠巨噬細胞亞型與人類有所不同，所以研究人員以人為研究對象，發現AS過程中斑塊中的M1和M2型巨噬細胞都顯著增加[10]。為了研究巨噬細胞亞型與斑塊的關系，研究人員比較了有癥狀的急性中風患者和無癥狀的急性中風患者的情況，結果顯示M1型巨噬細胞存在于有癥狀的患者的斑塊中，主要是不穩定斑塊[11]。M1型巨噬細胞表面高表達SR(Scavenger receptor)受體，這些受體可以介導細胞吞噬變性的脂蛋白如oxLDL。雖然M2型巨噬細胞具有抗炎作用，但是它們在AS發生過程中的功能是不同的。M2a型巨噬細胞可抑制大量炎癥因子如INF-γ、IL-1[12]釋放，M2b和M2c主要起調節作用，能通過調節慢性炎癥相關的多種因素來抑制M1型巨噬細胞產生，從而限制損傷進一步發展[13]。由于它們不合成細胞外基質以及趨化因子受體，所以M2b和M2c型巨噬細胞不具有組織修復的能力[14]。

3.2巨噬細胞亞型與脂質沉積相關 M2型巨噬細胞由于表達CD36、SR-A1等能增加脂質攝入的受體，所以易導致膽固醇的積累，過量積累的膽固醇激活LXR，導致ABCA1，ABCG1的大量表達，從而增加膽固醇的運出。當以上平衡被打破，如ABCA1，ABCG1表達缺失或活性降低，則導致脂質在M2型巨噬細胞中積累。過度積累的脂質將刺激M2型巨噬細胞轉換為M1型巨噬細胞，從而增加促炎因子分泌，促進粥樣斑塊形成。

AS發病初期巨噬細胞大量攝取氧化低密度脂蛋白，減少膽固醇運出，導致胞質中大量脂化膽固醇沉積，從而形成泡沫細胞[15]。巨噬細胞通過SR如CD36、SR-A1、lectin樣oxLDL受體1(lectin-like oxLDL receptor-1，LOX-1)等攝取oxLDL。酰基輔酶A、膽固醇酰基轉移酶1(Acyl coenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT1)和中性膽固醇酯水解酶(Neutral cholesterl ester hydrolase，nCEH)參與膽固醇脂類的形成[16]。ATP結合槽轉運體ABCA1，ABCG1將膽固醇運出巨噬細胞[17]。巨噬細胞吞噬脂質，大量脂質在細胞中積累，從而形成泡沫細胞。巨噬細胞中CD36，SR-A1，LOX-1介導脂質吞噬，ACAT1、nCEH催化巨噬細胞中的脂質形成膽固醇脂，ABCA1，ABCG1和SR-B1介導膽固醇運出細胞。

4 巨噬細胞亞型對AS的調節機制

目前，研究已發現多種調節巨噬細胞亞型的機制，如MicroRNAs(miRNAs)、轉錄因子、高密度脂蛋白(high-denstiy lipoprotein，HDL)、雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)及雷帕霉素靶點(mammalian/mechanistic target ofRAPA，mTOR)等。

4.1miRNAs調節 miRNAs是短的非編碼RNA，一般在22個核苷酸左右，這些核苷酸序列是高度保守的。mRNA通過RNA聚合酶轉錄，之后通過RNA酶Drosha和DGCR8形成miRNA前體。miRNA前體從細胞核進入胞質中，與胞質中的RISC復合體結合，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA與與目標mRNAs結合，導致mRNAs降解或抑制其轉錄。miRNA在巨噬細胞分化和功能的調節中發揮重要作用[34]。研究發現人和嚙齒動物的粥樣斑塊中都有miRNAs的表達[18,19]。其中研究最多最深入的是miR-155。研究發現miR-155在巨噬細胞中高表達。miR-155是一種由促炎作用的miRNAs，由TLR刺激表達，繼而增加促炎癥細胞因子的產生。此外miR-155通過抑制B細胞淋巴瘤-6蛋白(B-cell lymphoma-6 protein，BCL6)表達來增加CCL2和TNF-α表達，從而促進M1型巨噬細胞的活化[20]。miR-147是NF-κB信號通路的負反饋調節因子，有抑制NF-κB信號通路的作用，可降低炎癥巨噬細胞的免疫反應。miR-21及miR-146a/b也具有調節巨噬細胞亞型的作用，通過降低促炎因子產生，增加抗炎因子IL-10水平來激活M2型巨噬細胞，從而抑制NF-κB信號通路活化[21]。Let-7e通過抑制TLR4信號通路來抑制M1型巨噬細胞產生，miR125b下調IFN調節因子4轉錄因子來減少M1型巨噬細胞活化[22]。

4.2轉錄因子 大量研究發現核受體和轉錄因子在調節巨噬細胞亞型上具有重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ具有增加M2型巨噬細胞的作用，PPARγ能增加M2型巨噬細胞表面標記物如MR、AMAC、IL-10的作用。體外實驗中PPARγ在單核細胞分化初級階段起促進極化的作用。小鼠實驗表明PPARγ能促進巨噬細胞表達Arg1，而PPARα和PPARβ不能促進M2型巨噬細胞表面標記物的表達[23]。Kruppel樣因子(Kruppel-like factor，KLF)4能增加Arg1表達，從而增加M2型巨噬細胞，其機制是通過抑制NFκB信號通路來減少促炎因子的表達，并激活STAT6信號通路來上調Arg1表達[24]。雖然KLF4和KLF6都能調節巨噬細胞亞型，但是目前無明確結果證明這兩種轉錄因子能調節粥樣斑塊中巨噬細胞亞型。有研究發現LXRα能間接減少Arg1水平，從而抑制斑塊形成[25]。雖然M2型巨噬細胞具有抗炎作用，但M2型巨噬細胞容易囤積過量脂質。在人類巨噬細胞中，LXRα在CD68+MR+的巨噬細胞中低表達，這種巨噬細胞因為不能使內吞的脂質外流，所以容易引起脂質的過量積累。研究發現在小鼠體內NR4R家族成員與巨噬細胞分型相關，但是缺少人類細胞結果[26]。此外，研究顯示Nur77表達缺失的小鼠體內，巨噬細胞更易分化為具有促炎作用的M1型巨噬細胞。這是因為Nur77缺失可以導致IL-12，iNOS水平降低，TNF-α水平增加。

4.3HDLs HDLs具有抗動脈粥樣硬化的作用，機制是HDL具有逆向轉運膽固醇的作用。HDLs能將泡沫細胞的膽固醇轉運走，也能將膽固醇酯通過膽固醇至轉換蛋白形成富含甘油三酯的顆粒，從而形成乳糜粒殘余物和低密度脂蛋白。此外，HDLs還具有抗炎活性，如防止單核細胞粘附于血管內皮細胞表面等。

4.4RAPA和mTOR信號通路 RAPA是一種由放線菌鏈霉素產生的大環三烯類抗生素，具有免疫抑制的作用。RAPA能通過mTOR信號通路抑制T細胞增殖。mTOR是單核細胞、巨噬細胞以及髓樣樹突細胞存活和增殖的重要調節因子。體外和體內實驗都顯示RAPA能特異性導致M2型巨噬細胞死亡，而對M1型巨噬細胞無影響[27]。進一步研究發現，RAPA能通過增加CCR7，IL-6等M1型標記物水平，減少M2性標記物如IL-10，CCL18，VEGF的表達來改變M1型和M2型巨噬細胞比例。同時，有研究發現，小鼠骨髓源性巨噬細胞具有高mTOR復合物(mTORC1)活性，mTORC1能通過調節Akt信號通路非依賴性PPARγ來抑制M2型巨噬細胞標記物表達[28]。當加入mTOR抑制劑RAPA則能消除mTORC1的這種作用。目前，RAPA和mTOR在巨噬細胞分型上作用的機制尚不明確，有待進一步研究。

5 結論

動脈粥樣硬化的發病基礎主要有兩個，其一是膽固醇在血管壁中積累，其二是炎癥發生。膽固醇通過多種方式沉積于巨噬細胞，形成泡沫細胞。泡沫細胞進一步分泌多種促炎細胞因子，促進粥樣斑塊形成。巨噬細胞亞型與高脂血癥所致的動脈粥樣硬化的關系復雜，動脈粥樣硬化過程中多種因子參與調節巨噬細胞亞型，不同亞型巨噬細胞又通過不同機制如通過miRNA、轉錄因子等調控血管周圍的炎癥反應及脂質沉積等，從而影響動脈粥樣硬化的轉歸。本研究對巨噬細胞亞型與動脈粥樣硬化的相互作用進行深入探析，旨在揭示動脈粥樣硬化的發病機制，從而為尋找更加有效的藥物防治動脈粥樣硬化性疾病提供新的思路。