外泌體與放射性肺損傷相關性的研究進展

張琨明，于倩倩，何環宇，莫文倩，林慶鏗，陳 宏

(1.昆明醫科大學研究生院，昆明 650031； 2.聯勤保障部隊第九二○醫院腫瘤科，昆明 650032)

近年來，放療已成為胸部腫瘤最重要的治療方法之一。盡管通過先進的放射技術向腫瘤患者提供更多的局部劑量可以提高生存率和減少輻射相關毒性，但放射性肺損傷的發生仍是不可避免的。放射性肺損傷既限制了胸部放療劑量的增加，導致腫瘤控制不佳，又影響接受放療的腫瘤患者的生存率和生活質量。X線照射肺組織時，細胞受到輻射的直接或間接損傷,一旦輻射劑量超過輻射閾值，輻射損傷可能超出人體固有的修復能力，導致肺損傷[1]。研究人員一致認為電離輻射可引起上皮、內皮細胞的損傷和血液空氣屏障功能障礙，增加血管通透性，電離輻射進一步殺傷肺泡巨噬細胞，上調轉化生長因子-β1(transforming grow factor-β1，TGF-β1)，腫瘤壞死因子、白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6/IL-12，激起體內炎癥和免疫反應而導致肺損傷[1]。外泌體是直徑20～200 nm的膜囊泡[2]，在體內介導細胞之間或組織之間的通信，作為運輸小泡參與體內多種生理過程和疾病發生。目前外泌體在炎癥和免疫方面有很多研究，但是參與放射性肺損傷的發病機制尚不清楚。現對外泌體參與放射性肺損傷發生機制進行綜述，為放射性肺損傷的預防和治療提供新思路。

1 外泌體

外泌體是細胞自主向胞外分泌的膜囊泡，其由蛋白質(轉錄因子、酶、熱激蛋白等[3])、寡核苷酸(DNA、信使RNA、miRNAs和非編碼RNA等[4])和代謝物(脂類、乳酸、谷氨酸等[5-6])組成。外泌體在細胞之間以及在不同組織之間形成一個遺傳信息通信網絡，可以通過讓基因組片段在外泌體內的運輸使遺傳信息能夠在單個細胞的邊界之外傳播[7]。外泌體由各種細胞分泌，如內皮細胞、平滑肌細胞和腫瘤細胞等，存在于人類體液中[8]。不同細胞或組織分泌的外泌體內含有的物質和功能不同，所以在組織中的作用也不同。此外，外泌體由于有各種各樣的生物分子，影響和調節若干重要的生物功能，包括細胞生長、分化、免疫反應、激素激活和代謝等[9]。組織在氧化應激、缺氧、輻射及細胞損傷或炎癥細胞活化期間，也會積極地產生外泌體。在多種疾病的發病機制和治療、介入治療和靶向治療及腫瘤等疾病生物標志物的研究方面也具有新的潛力[3]。

2 放射性肺損傷

放射性肺損傷是胸部腫瘤放療最常見的并發癥，增加放療劑量或增加照射肺體積，聯合化療可明顯增加放射性肺損傷的風險[9]。放射性肺損傷以低氧血癥、非心源性肺水腫、肺低順應性和廣泛的毛細血管滲透為特點[10]，早期表現為滲出性炎癥，暴露后6～12周并發間質性肺炎，晚期以慢性炎癥、組織重塑和肺纖維化為特征[11]。

細胞因子在放射性肺損傷的發生發展中有重要作用。放療后許多細胞因子在肺部表達，促進炎癥細胞的活化、聚集導致急性放射性肺炎的發生。放射性肺損傷涉及兩種細胞因子：第一種為腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-6和單核細胞趨化肽，第二種為TGF-β1和成纖維細胞生長因子，第一種因子負責炎癥介導的反應，第二種因子可促進成纖維細胞的增殖和分化，調節細胞外基質的代謝[12]。IL-6可通過促進炎癥和纖維化導致小鼠的過敏性肺炎[12]。TGF-β1是發生纖維化的標志產物，可通過TGF-β信號通路(主要有Smad依賴和非依賴兩種)引起炎癥和纖維化反應[13]。腫瘤壞死因子-α在放射性肺損傷中參與炎癥反應的誘導和放大，而成纖維細胞通過膠原和其他細胞外基質蛋白的產生在纖維過程中發揮關鍵作用[11]。

電離輻射可以直接產生活性氧，活性氧一方面直接攻擊細胞和組織的生物膜，刺激成纖維細胞增殖和膠原形成，導致肺組織變性和壞死。另一方面，活性氧通過細胞內信號轉導和基因表達介導肺細胞凋亡，對蛋白質、核酸、脂質等生物大分子造成直接的DNA損傷，并對組織和細胞造成損傷[14]。輻射引起的遠期效應部分是由慢性氧化應激和炎癥引起的，導致脂質過氧化、DNA和蛋白質的氧化以及促炎癥細胞因子的激活[15]。超氧陰離子自由基和羥基自由基等自由基的形成是放療不可避免的結果,這些自由基激活TGF-β1，促進上皮細胞凋亡[10]。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)家族在放射性肺損傷中扮演重要角色，可以降低細胞外基質的所有種類蛋白[12]，MMP-9可以減少肺內皮細胞基膜，導致肺上皮和血管內皮細胞損傷，降解細胞外基質，加重肺損傷[13]。Selman等[16]研究發現特發性肺纖維化患者體內MMP-2和MMP-9過表達導致肺纖維化。有研究表明蛋白激酶B信號通路在促進MMP-2和MMP-9表達中起重要作用[12]。

3 外泌體與放射性肺損傷

3.1免疫機制 免疫紊亂是放射性肺纖維化的驅動力[17]。研究者一致認為，電離輻射可引起上皮細胞和內膜細胞的損傷，血氣屏障功能障礙，增加血管通透性，電離輻射可以進一步激活肺泡巨噬細胞，上調TGF-β1、腫瘤壞死因子-α、IL-1β、IL-6、IL-12(尤其是關鍵因子TGF-β1)[18]。人體的免疫反應可以放大這一過程，增加局部炎癥反應，引起間質性肺炎的發展，慢性炎癥的持續性最終導致肺纖維化[19]。巨噬細胞和成纖維細胞被ILs、TGF、腫瘤壞死因子、血小板源性生長因子誘導活化，巨噬細胞分泌ILs和腫瘤壞死因子-α，腫瘤壞死因子-α通過誘導細胞間黏附分子的表達和前列腺素及其他炎癥介質的產生來介導放射性肺炎和纖維化的產生[20]。Moon等[21]研究證明肺上皮細胞衍生的外泌體傳遞胱天蛋白酶3(一種促凋亡因子)，通過Rho相關的coiled-coil激酶Ⅰ激活巨噬細胞，這成為肺上皮細胞衍生的外泌體從血液中消失可以減輕體內肺損傷的機制。同樣，肺巨噬細胞衍生的外泌體釋放IL-36γ(一種促炎細胞因子)，可能會引起細菌性肺損傷。在治療肺炎中可以通過直接阻斷外泌體為基礎的巨噬細胞-上皮旁分泌間的“對話”來減輕炎癥[4]。

癌蛋白MYC誘導在乳腺癌細胞分泌的外泌體中的miR-105，miR-105反過來激活在癌相關成纖維細胞的MYC信號去誘導代謝過程[22]，MYC在調節腫瘤微環境，特別是腫瘤基質的炎癥和免疫成分方面有重要作用[23]。用Western Blot發現照射20周后的小鼠進行C-MYC分析示照射組C-MYC較對照組升高,且應用輻射防護劑后C-MYC降低[24]。可以推測C-MYC可能與放射性肺炎相關，而癌細胞外泌體分泌出的miR-105誘導了C-MYC升高的發生。

研究者發現間充質干細胞外泌體可以使人外周血單核細胞中的IL-10和TGF-β1增多，促進T淋巴細胞的增殖和免疫抑制能力。抗原呈遞細胞是MSC外泌體介導的可能機制。骨髓間充質干細胞可通過上調T淋巴細胞的增殖和免疫抑制能力以減輕哮喘氣道炎癥[25]。T淋巴細胞能促進上皮間充質轉化加速放射性肺纖維化的發生，β聯蛋白作用是發生的可能機制[26]。還有研究在MSC外泌體內檢測到200多種免疫活性蛋白[27]。創傷/失血性休克誘導巨噬細胞活化及促炎細胞因子的產生。體內實驗表明，創傷/失血性休克后而非休克前產生的外泌體，可引起肺內炎性細胞的聚集，增加血管通透性，并誘發幼鼠的急性肺損傷[28]。所以以上可以證明外泌體在體內外具有激活免疫細胞的潛力，而免疫細胞通過分泌多種抗炎因子來減輕炎癥反應，可以推測在放射性肺炎的產生機制中，外泌體有一定的抗炎和免疫調節作用。

3.2氧化應激 DNA在放射急性期的直接損傷和間接的氧化應激可引起細胞凋亡[29]。在氧化應激下小鼠肥大細胞釋放的外泌體可以傳遞保護信號，這種保護信號是通過使受體細胞對氧化應激產生抵抗力來影響其他細胞對氧化應激的反應，從而保護受體細胞，增加應對氧化應激的能力，減少細胞凋亡[30]。外泌體釋放的RNA可能就是外泌體在氧化應激中傳遞的保護信息。

研究發現心肌再灌注損傷的主要特征是腺苷三磷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的丟失、氧化應激的增加和細胞凋亡。間充質干細胞外泌體可增加心肌缺血再灌注損傷后ATP水平，減少氧化應激，激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路，增強心肌活力，防止心肌不良重構[31]。還有研究發現鼻內注射間充質干細胞衍生的外泌體可減少小鼠慢性乙醇攝入導致的大腦氧化應激和神經炎癥[32]。骨髓間充質干細胞衍生外泌體顯著降低了氧化應激損傷后細胞凋亡率和抑制活性氧的產生，而miR-214是主要效應分子[33]。低氧可顯著上調慢性腎臟病患者miR-214-3p的表達，miR-214-3p基因敲除逆轉上皮間充質轉化減輕單側輸尿管梗阻小鼠腎纖維化，而過表達miR-214-3p促進了缺氧下腎小管上皮細胞的上皮間充質轉化表型和纖維化因子的表達[34]。所以外泌體可以減少氧化應激和細胞凋亡，外泌體通過釋放miR-214可以減輕細胞的氧化應激損傷，但是過表達miR-214反而促進纖維化。

3.3纖維化相關基因上皮鈣黏素 上皮鈣黏素是纖維化相關基因，缺氧誘導Twist/miR-214/上皮鈣黏素軸的激活，加速腎纖維化[34]。上皮鈣黏素可以從外泌體內被切割并以可溶性形式釋放出來，上皮鈣黏素產生的蛋白質se-cad存在于卵巢癌細胞分泌的外泌體中，研究表明se-cad能介導血管通透性[35]。放射性肺炎是一種滲出性炎性改變，如炎性細胞浸潤或蛋白性物質滲出等。放射性肺纖維化始于肺泡毛細血管屏障破壞和愈合異常[26]，這可能與上皮鈣黏素編碼的蛋白質se-cad介導血管通透性有關。se-cad陽性外泌體可激活核因子κB信號級聯反應[35]，免疫反應和炎癥反應均與核因子κB通路相關[36]。核因子κB可以抑制miR-29b的表達，特發性和博來霉素誘導的肺間質纖維化的研究證實，miR-29表達較正常肺上皮明顯降低，下調miR-29促進膠原蛋白和層粘連蛋白的產生和沉積[36]，所以se-cad陽性外泌體可以通過激活核因子κB抑制miR-29b的表達來促進肺纖維化。

3.4RNA 在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中，血清外泌體的miR-21-5p在急性炎癥期和纖維化后期均顯著升高，同樣特發性肺纖維化患者外周血外泌體miR-21-5p表達也增加[2]。Fujita等[37]研究發現香煙煙霧提取物誘導的人支氣管上皮細胞衍生的細胞外囊泡miR-210在肺纖維化中促進了肌成纖維細胞的分化。在巨噬細胞活化過程中miR-155和miR-146a的表達參與了炎癥反應和內毒素耐受的調控[38]。內源性miR-155和miR-146a是調節炎癥反應的兩種關鍵miRNA，其中外泌體介導的miR-155增強，miR-146a降低炎癥的發生。研究還發現miR-155、miR-146a存在于外泌體以及免疫細胞之間，并證明miR-146a能抑制而miR-155促進內毒素誘導的小鼠炎癥反應[39]。所以可以推斷外泌體中的RNA與放射性肺炎或纖維化過程有一定的相關性。

研究表明哮喘患者痰中存在外泌體而且外泌體內含有RNA[40]。特發性肺纖維化患者痰液外泌體中miR-142-3p與肺功能負相關，也是疾病的潛在參與者[41]。miRNAs：let-7d，miR-26a-5p，miR-29b-3p和miR-423-3p參與了炎癥性疾病的發展，尤其在特發性肺纖維化的發生發展過程中起重要作用，如細胞外基質的沉積、膠原的分泌和上皮向間充質的轉化等。研究表明miR-33a-5p還與肝纖維化有關[41]。雖然放射性肺損傷患者痰液外泌體是否成為衡量嚴重程度的指標和是否參與了放射性肺纖維化還有待進一步研究，但是為研究放射性肺損傷嚴重程度指標和發生機制提供了新的方向。

3.5細胞因子和酶 放射性肺炎涉及促炎細胞因子的產生，導致炎性免疫細胞浸潤和破壞肺實質、基質和上皮細胞。此外，已知放射性肺炎發展為放射性肺纖維化，其特征是成纖維細胞增殖、膠原累積和破壞正常的肺結構[42]。①IL和TGF-β：一種新的IL-1模型涉及嘌呤能離子通道型受體7誘導的多泡體的形成，其中包含包裹IL-1β的外泌體，觸發IL-1β和主要組織相容性復合體Ⅱ共同釋放是炎癥聚集和半胱天冬酶1激活的常見和絕對必要條件[43]。IL-1β在胸部照射后顯著升高，在體內外均可觸發促纖維化TGF-β的產生，提示IL-1在放射性肺損傷的發生發展中起重要作用，下調IL-1可以維持炎癥因子的穩態來改善放射性肺損傷[44]。TGF-β1是誘導上皮-間充質轉化的必要細胞因子，可促進肺上皮細胞的上皮-間充質轉化，在肺纖維化中起重要作用[19]。另一項研究示間充質干細胞外泌體可升高人外周血單核細胞中的IL-10和轉化生長因子[25]，高IL-10水平抑制炎癥反應，如中性粒細胞滾動、黏附和跨膜遷移在炎癥宿主中的變化，可減輕急性肺損傷[45]。②肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)：在靶向治療中，外泌體能夠在體內轉移HGF的小分子干擾RNA，降低腫瘤和血管的生長速率[46]。Zhang等[47]證明基于間充質干細胞的HGF基因治療不僅可以減輕炎癥反應，而且可以抑制放射性肺纖維化的發展。HGF是刺激血管生成、抑制纖維化、減少凋亡的多功能因子[48]，在細胞凋亡調控中起關鍵作用[49]。研究表明，HGF調節大鼠肺泡上皮細胞中TGF-β1誘導的肌成纖維細胞標志物,如α平滑肌肌動蛋白、膠原1和纖維連接蛋白的表達。HGF影響TGF-β1信號抑制劑Smad7的表達[50]，從而減輕纖維化產生。③超氧化物歧化酶：研究證實心臟特異性高表達熱激蛋白20的轉基因小鼠，小鼠心肌細胞衍生的外泌體包裹更高水平的熱激蛋白20、p-Akt蛋白、存活蛋白和超氧化物歧化酶1[51]，超氧化物歧化酶1可以減輕輻射誘導的肺內皮細胞損傷和功能障礙[1]。④MMP：在放射性肺損傷早期，MMP的表達和活性顯著增加。MMP的合成抑制劑Ilomastat預處理可降低MMP的表達和活性，明顯減輕受照小鼠的肺炎癥和纖維化，提高受照小鼠的存活率[51]。MMP可以通過從細胞表面內化，再循環到質膜，然后參與小泡的生物發生，一部分被外泌體包裹，重新定向到胞外分泌[52]。

4 小 結

外泌體在體內介導細胞之間或組織之間的通信，作為運輸小泡參與體內多種生理過程和疾病發生，目前在炎癥和免疫等方面有很多研究，分泌物從RNA、蛋白質到細胞因子，對組織或細胞起的作用取決于分泌外泌體的細胞和組織的種類，同時又受多種刺激的影響，以及分泌時環境的影響。放射性肺損傷與免疫系統，炎性因子，以及RNA和酶，細胞通路都有一定的關系，而外泌體就成為參與這些活動的重要囊泡，隨著外泌體被越來越多研究者所關注，研究者將會對外泌體有更深的了解，從而為放射性肺損傷機制研究和治療、預防的探索提供新思路。