孕婦外周血無創DNA檢測技術在產前診斷中的應用*

燕 鳳，燕 飛，姚念玲，陳必良，徐 慧，鄭 嬌，任菊霞，程 璐，李春艷，張建芳

(1.空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科，西安 710032；2.石家莊學院，石家莊 050035)

尋求一種安全、簡單、經濟、實用的產前篩查及診斷方案，對降低出生缺陷具有重要意義。隨著分子生物學技術的發展，無創產前DNA檢測(NIPT)是基于母體外周血中含有胎兒游離DNA片段(cell-free fetal DNA)的基礎上發展起來的一種檢測技術[1]。NIPT技術對常見的三大染色體非整倍體(T21，T18，T13)有較高的敏感度和特異度，但是，NIPT檢測的準確性也遠未達到以往報道的100%，因此，本研究通過對493例在西京醫院婦產科產前診斷中心接受NIPT檢查者的陽性結果進行分析驗證，比較NIPT與有創產前診斷結果的符合率，探討NIPT技術在胎兒染色體非整倍體疾病的早期診斷和預防中的優勢和應用價值，為該技術在產前診斷的合理應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析從2015年11月～2018年6月在西京醫院婦產科產前診斷中心因NIPT篩查結果高風險的孕婦羊水資料493例，孕婦年齡為33.71±3.43周齡，其中年齢超過35歲的孕婦81例。NIPT檢測時的孕周為17.69±2.13周齡。雙胎孕婦72例，單胎孕婦421例。孕婦NIPT篩查的指征：NT增厚，血清學篩查陽性，高齡孕婦年齡≥35歲，異常生育史，胎兒超聲檢查異常等。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：無創DNA試劑采用博奧和貝瑞和康試劑盒，FISH試劑采用金菩嘉探針，芯片采用AffymetrixCytoScan 750K CNV+SNP芯片，羊水培養基采用張氏和Gibco細胞培養基。

1.2.2 儀器：無創博奧平臺采用晶芯Bioelectron4000測序平臺，無創貝瑞和康平臺采用NextSeqCN500測序平臺，FISH采用IMSTAR FISH熒光原位雜交分析系統，芯片采用Affymetrix CytoScan芯片平臺，羊水培養采用Thermo培養箱。

1.3 方法

1.3.1 NIPT檢測技術：抽取孕婦外周血5 ml 用EDTA抗凝，提取血漿游離DNA，經過末端修復，接頭連接，構建文庫，PCR擴增，富集后得到測序文庫，質控合格后采用Ion Proton高通量測序儀檢測，結果進行高通量分析，并通過生物信息學分析計算Z值，當Z值≥3，三體高風險，當Z值≤3，單體高風險。對高風險孕婦進行羊水穿刺驗證結果。對無異常結果進行產前產后電話追蹤隨訪，判斷有無假陰性出現。

1.3.2 核型染色體制備：受檢者妊娠孕周均在18～36周，B超定位經腹部羊水穿刺取樣，每次取材的羊水量為20～30 ml，將新鮮的羊水移入15 ml離心管1 500 r/min離心5 min，去上清留沉淀0.5 ml，分別接種于兩個培養瓶中，采用G顯帶法，進行羊水細胞染色體核型分析。

1.3.3 FISH：未培養的羊水6 ml，2 000 r/min離心10 min，棄上清。羊水細胞加6 ml的KCl，37℃低滲21 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清。羊水細胞用甲醇∶冰醋酸3∶1固定液固定10 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清，重復2次，第三次加1～2 ml固定液后，混勻滴片，烤片機上50℃干燥90 min，溫度冷卻至室溫后放2×SSC 10 min，再逐次放入70 ml/dl，85 ml/dl和100 ml/dl的酒精中各2 min洗片，室溫干燥，玻片放入70℃預熱好的甲酰胺變性液中預變性5 min后，快速放入-20℃預冷的70 ml/dl，85 ml/dl和100 ml/dl的酒精脫水3 min，晾干。避光配好探針后放73℃水浴鍋變性5 min，加探針到玻片上，封片膠封片，46℃雜交過夜16 h后，46℃預熱好的2×SSC洗片10 min，室溫70 ml/dl，85 ml/dl和100 ml/dl的酒精中各2 min洗片，室溫避光干燥，加蓋玻片鏡下檢測分析，每個雜交區至少數100個信號強、無重疊的雜交細胞。陽性判斷標準：CSP18/X/Y探針和GLP13/21探針至少數100個細胞，非整倍體細胞比例>60%判為非整倍體，非整倍體細胞比列>30%為嵌合體。

1.3.4 基因芯片：抽取10 ml羊水行基因芯片分析，采用Affymetrix CytoScan 750K CNV+SNP芯片進行檢測，以數據通過ChAs軟件進行分析。CNV對比CNVs數據庫OMIM(http：//omin.o-rg)，ISCA(https：//www.iscaconsortium.org/isca/ucsc/hg19)，DECIPHER(https：//decipher．sanger．ac．uk) 比對分析，在Pubmed數據庫上檢索相同或相似區段的CNV研究文獻，綜合分析。

1.3.5 追蹤隨訪：對因無創陽性做羊水穿刺確診的孕婦進行電話隨訪，隨訪其妊娠結局或出生后孩子的性別及出生后的健康狀況。

2 結果

2.1 無創DNA結果與介入性產前診斷結果的比較分析 見表1，表2，表3。

表1 NIPT高風險病例有創產前診斷結果

注：PPV為真陽性病例數/總病例數。

NIPT檢出孕婦外周血493例陽性，其中21三體、13三體、18三體、性染色體和其他染色體陽性例數分別為：232，32，46，125和58。通過介入性產前診斷分別確定他們的真陽性為：21三體178例，13三體3例，18三體23例，染色體異常46例，其他染色體7例。陽性預測值(PPV)分別為：76.7%，9.4%，50.0%，36.8%，12.1%。五組陽性預測值間差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 NIPT性染色體非整倍體高風險病例有創產前診斷結果

表3 NIPT提示的其他非整倍體病例的有創產前診斷結果

2.2 隨訪結果 493例無創DNA結果異常的孕婦均對其進行了電話隨訪，其中經產前診斷確定染色體異常結果共236例，引產235例，其中1例胎兒核型46，XX/46，XY(17%)，孕婦不想引產，經隨訪出生后3個月未發現異常，但這還需要長期跟蹤隨訪其生育能力及性腺發育才能確定。有1例孕婦因過分焦慮無創提示21三體，產前結果還未出來時經勸說無效，隨訪后發現孕婦已引產。其中256例無創DNA假陽性結果經染色體核型，FISH和基因芯片確認染色體核型正常的出生后電話隨訪，有6例沒有隨訪到，其余家屬均口述發育正常、健康，隨訪發現性別與染色體結果均一致。

3 討論

我國出生缺陷發生率高達5.6%[2]，其中，染色體異常在新生兒中的發生率約占0.5%～1%[3]，為了預防出生缺陷，產前篩查與診斷工作尤為重要，傳統的產前診斷方式以侵入性為主，但該技術存在一定風險性，有0.5%～2.0%的流產風險并易導致相應并發癥[4]，因此孕婦外周血無創DNA技術以無創性和相對較高的準確性在臨床獲得了較廣泛的應用。然而，NIPT并不是一個診斷性的篩查胎兒非整倍體的方法，因此，NIPT的陽性結果需要侵入性的產前診斷技術去確定[5]。據此，我們驗證了493例，NIPT提示五對常見非整倍體及其他染色體高風險病例，得出NIPT對五對常見染色體非整倍體的篩查以21三體最為準確，陽性預測值為76.7%(178/232)，對13三體的篩查準確性最弱，陽性預測值僅為9.4%(3/32)。關于13三體篩查準確性較低的原因，有研究表明可能是由于13號染色體的鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸和胞嘧啶脫氧核糖核苷酸含量較低，導致測序時產生偏差，或由于13三體孕婦的胎盤較小，釋放入母血的游離胎兒DNA數量相對較少造成[6]。2015年的研究指出，妊娠女性血漿的游離DNA分子濃度顯著高于非妊娠健康女性的游離DNA分子的相應濃度，妊娠母體血漿游離總DNA片段大小主要集中于100 bp左右，如果要研發基于妊娠母體游離DNA的無創性產前分子診斷技術，需要將PCR擴增片段控制在100 bp以內，才能得到更為準確的檢測結果，有效地避免大片段擴增可能導致的假陰性結果[7]。同時我們的研究結果也發現無創對性染色體非整倍體的檢測相對較低，這是由于性染色體的檢測中，由于X和Y染色體上存在基因同源性等影響因素，其對性染色體疾病診斷的檢出率和準確率受到一定限制，性染色體疾病和部分染色體片段重復和缺失的檢測可能是無創性產前基因檢測技術亟待解決的問題[8]。同時，我們發現，NIPT技術對性染色體中45，X的陽性預測值最低，其原因可能與限制性胎盤嵌合體，孕婦血清胎兒游離DNA含量低，母親染色體嵌合及母親存在潛在性腫瘤及X染色體的非隨機失活都有關系[9]。目前NIPT篩查大致可分為兩大類：一類是目前使用比較成熟的5對染色體13，18，21和性染色體的篩查；另一類是除5對染色體外的其他染色體非整倍體的篩查，準確性較差。因此，無創DNA對其它染色體的檢測一般在報告單中不展現，只是起提示作用。NIPT結果假陽性也受到母體嵌合體的影響，如母體為染色體異常者、母體的體細胞嵌合、母體的癌細胞、腫瘤細胞等因素都會增加NIPT假陽性的發生率。WANG[10]等研究發現NIPT中8.6%的假陽性結果都是由母體嵌合引起的。因此，隨訪中當我們發現NIPT結果和侵入性產前診斷結果不一致時，可考慮對母體進行細胞遺傳學分析，通過對母體的細胞遺傳學分析，發現母體嵌合體對NIPT結果的影響，在這種情況下是可以避免不必要的侵入性診斷檢測。

綜上所述，孕婦外周血無創DNA產前篩查存在一定假陽性結果，孕婦外周血無創DNA產前檢測陽性結果必須通過羊膜腔穿刺進行確診。孕婦外周血無創DNA檢測結果陰性時，一定要嚴格進行B超檢查。當B超檢查結果正常時，孕婦按照醫院規定的產檢流程即可。目前，孕婦外周血無創DNA技術對21三體綜合征具有較高的準確率，這在同類研究也有報道[1]，目前并不能代替侵入性產前診斷技術。隨著測序成本的下降以及技術和算法的進步，解決方案的優化，孕婦外周血無創DNA對基因組的分析范圍、分辨率和深度將會增加。未來的幾年許多國家將會進一步普及孕婦外周血無創DNA技術，這將導致侵入性產前診斷會大幅度的減少。