臨床血流感染沙門菌的分型及同源性與耐藥性分析*

周俊英，田宏攀

(武漢大學中南醫院檢驗科，武漢 430071)

關鍵字：沙門菌；血清分型；基因分型；耐藥性；腸桿菌科基因間重復序列的聚合酶鏈反應；同源性分析

沙門菌是引發食源性疾病的主要病原菌之一[1]，沙門菌感染主要通過被沙門菌污染的肉類、蛋類、乳制品等而引起發病，沙門菌經口傳播，早期進入血流，感染后多表現為敗血癥。沙門菌的耐藥問題日益嚴重，以前廣譜的頭孢菌素和氟喹諾酮類抗生素推薦用于治療非傷寒沙門菌感染[2]，但頭孢曲松和環丙沙星耐藥的沙門菌不斷被報道[3]。本文對臨床血流感染沙門菌分型及同源性和耐藥性關系的分析，為臨床血流感染的檢測和指導臨床用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 10株沙門菌來自于2015～2017年武漢大學中南醫院微生物室，分離自本院發熱病人的血液中。

1.2 主要試劑 MH瓊脂、血平板由廣州迪景公司提供，鑒定卡和AST-GN13藥敏卡片由旭航公司提供，沙門菌抗原診斷血清購自浙江寧波天潤，TaqDNA聚合酶和dNTPs由Fermantas公司提供，DNA Marker 100bp由廣州東盛提供，質粒少量制備試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，ERIC引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌鑒定及藥敏實驗：采用Vitek compact 2全自動細菌鑒定及藥敏分析儀進行沙門菌的鑒定，藥敏卡AST-GN13進行藥敏試驗，測定最小抑菌濃度(MIC)，結果判讀參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)M100-S23標準，質控菌株為大腸桿菌ATCC25922，購自衛計委臨床檢驗中心。

1.3.2 血清型鑒定：用A～F多價O血清做玻片凝集實驗，生理鹽水對照，若有凝集，再依次用O單價血清做凝集，根據凝集實驗結果判斷O群，然后根據O抗原進行H抗原和鞭毛抗原的血清凝集，必要時進行誘導實驗，最后根據O抗原和H抗原判斷沙門菌的血清型別。

1.3.3 細菌質粒的提取及基因的檢測：質粒的提取采用的是質粒小量試劑制備盒提取，按照試劑說明書操作進行。

1.3.4 PCR擴增體系：總體積為10 μl，包含DNA模板2 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，上、下引物各為0.5 μl，10×PCR緩沖液1.2 μl，DNA聚合酶(5 U/μl)0.1 μl，雙蒸水5.2 μl。

1.3.5 反應條件：預熱95℃3 min變性，96℃30 s，退火 42℃50 s，延伸72℃1 min，30個循環，72℃5 min。

1.4 聚類分析 將ERIC-PCR電泳譜帶數據轉換成矩陣，用“1”和“0”代表譜帶的有和無，然后運用Cluster 3.0軟件對10株擴增產物進行相似性分析，聚類分法選用非加權組平均法。

2 結果

2.1 沙門菌血清學分型結果 10株沙門菌均符合三糖鐵斜面紅色，底部黃色，底部出現部分或全部黑色，鑒定儀鑒定為沙門菌，按照國標要求對沙門菌進行血清學分型，必要時進行誘導和傳代，血清型A型1株，為甲型傷寒沙門菌；B型3株，2株乙型副傷寒沙門菌和1株鼠傷寒沙門菌；D型為6株，4株為傷寒沙門菌，2株為腸炎沙門菌。患者年齡19～81歲，男女患者比為9∶1．

2.2 沙門菌質粒的分型 對10株沙門菌質粒進行瓊脂糖凝膠電泳，10株沙門菌含有質粒的是2，3，4，5，8號菌株，不含質粒的是1，6，7，9，10號菌株，2號菌株含有2種質粒，分子量約為20 kb和35 kb；8號菌株含有2種質粒，分子量約為15 kb和20 kb；3，4，5號菌株含有分子量相同的1種質粒，分子量約為35 kb。

2.3 10株沙門菌對抗生素的耐藥性 依據CLSI2017年指南，我們對4類抗生素進行藥敏試驗，10株沙門菌中，氨芐西林有2株為敏感，敏感率為20.0%(2/10)，頭孢他啶敏感率為100.0%(10/10)，甲氧芐啶-磺胺甲唑敏感率為80.0%(8/10)，左氧氟沙星1株敏感，8株中介，1株耐藥，敏感率為10.0%(1/10)。

2.4 沙門菌的基因分型 對10株沙門菌進行ERIC-PCR擴增，結果見圖1。每種菌株有不同的條帶，最多的有10條帶，最少的有2條帶。

(M為marker，1～10為菌株號)

2.5 沙門菌的同源性分析 用Cluster 3.0軟件對10株沙門菌擴增產物做聚類分析，4號和10號菌株的相似性最高，達85.70%，其次是8號和9號菌株相似性為83.70%，具有高度同源性，7號菌株與這兩株菌相似性為72.50%。1號與2號菌株、5號和6號菌株的相似性分別為73.00%，70.70%，具有一定的同源性。3號與1號、2號菌株的相似性僅為44.70%，不具有同源性。結果見圖2。

圖2 沙門菌聚類分析圖譜

3 討論

抗生素的不合理使用導致沙門菌對青霉素和喹諾酮類藥物耐藥率越來越高，國內外已有文獻報道，沙門菌在某些地區已經出現喹諾酮類藥物高水平耐藥，主要是由于喹諾酮耐藥決定區(QRDR)基因的突變[4]和喹諾酮耐藥基因qnr及aac(6’)-Ib-cr的攜帶[5]，gyrA的點突變被認為在高喹諾酮類耐藥革蘭陰性菌的所有耐藥機制中占主導地位，也被嚴海忠等[6]人從鼠傷寒沙門菌中得到印證。質粒介導的耐藥對細菌耐藥起著一定作用，質粒檢出的數量越多，多重耐藥性越強[7]。本研究的10株沙門菌中，檢出3種類型的質粒譜型，都是大分子質粒，如含有2種質粒的2，8號菌株，含有一種質粒的3，4，5號菌株，這些菌株的多重耐藥率高于不含質粒的菌株。

10株沙門菌對氨芐西林和左氧氟沙星敏感率較低，對氨芐西林耐藥率為80.0%，左氧氟沙星耐藥率為10%，但左氧氟沙星中介率高達80.0%，因此青霉素類和喹諾酮類已不適合一線抗生素治療，沙門菌對第三代頭孢菌素及磺胺類藥物仍有較高的敏感率，可作為沙門菌感染患者的經驗性用藥，對沙門菌引起的血流感染也可采用亞胺培南進行降階梯治療。

臨床醫生應重視沙門菌血流感染的病原學診斷，合理使用抗生素，盡量避免選用氨芐西林及左氧氟沙星藥物，可選擇第三代頭孢及碳青霉烯類抗生素來治療。