慢性腎臟疾病晚期患者的尿代謝組學特征分析*

馮 琴，尚小玲，李 智，胡 芳

(1.鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)醫學檢驗科，湖北黃石 435000；2.澳門大學健康科學學院，澳門 999078)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的發病率顯著上升已成為我國和其他國家一個嚴重的公共衛生問題[1，2]。根據腎小球濾過率(eGFR)的變化可以將CKD分為五個階段，最近的研究表明，同時監測eGFR和蛋白尿能夠準確地反映CKD的病情進展[3]。一般來說，臨床醫生基于血清肌酐中eGFR的值來判斷是否為CKD。血清肌酐受肌肉質量、年齡、種族和早期評估的影響，另外當eGFR的值超過60 ml/min時再用這種方法評估并不準確[4]。一些新的分析物如中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C也發現與CKD進展有關，但是以往的研究多是建立在有限的研究對象基礎上，而且各研究中采用的診斷標準及方法的不同造成了診斷效能評估等結果的差異[5]。因此需要發掘新的生物標志來識別CKD患者甚至識別早期CKD階段，并最終被用來監測疾病的進展。

實驗中運用NMR和MS的方法對CKD患者和健康人尿液進行非靶向分析，檢測結果發現一些潛在的重要代謝物，具體研究如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象 CKD患者的尿樣收集來自鄂東醫療集團黃石市中心醫院。收集31例(15例對照組和16例患者)的尿液用于探索階段，另收集30例(15例對照組和15例患者)用于驗證階段。招募5例CKD(3～5期)的患者和7例新的健康受試者用于雙盲實驗。CKD階段(3～5期)被定義為GFR值高于30 ml/min/1.73 m2。驗證階段對照組無糖尿病史、高血壓、腎臟或炎癥性疾病，沒有接受任何已知的藥物來干擾研究的變量，并根據性別和年齡與患者組相匹配。

1.2 主要儀器和試劑 NMR檢測在華中科技大學進行，儀器型號為AVANCE400MHZ。液相色譜-三重四極桿質譜儀，型號為安捷倫6460 QQQ MS(6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer)，液相色譜系統由一個脫氣裝置，兩個二元泵和恒溫自動進樣器組成(1200系列，安捷倫科技，帕洛阿爾托)。實驗由上海愛博才思分析儀器貿易有限公司完成。恒溫反相色譜柱型號為Atlantis T3(3 mm，2.1×100 mm2)，購自Waters公司。冷凍離心機(75002430)購自ThermoFisher。本實驗中所用試劑，甲酸、乙腈、乙酸等均購自美國Sigma公司。

1.3 標本采集 收集所有患者的晨尿，并于13 000 r/min，4℃下離心15 min，去除細胞碎片，保存上清，并保存于-80℃直到分析。液相色譜實驗：將10 μl樣品注射進樣于40℃恒溫的反相色譜柱中。使用乙腈溶液進行梯度洗脫，洗脫速率為0.4 ml/min：0%的B液5 min，0～10%的B液2 min，10%的B液3 min，10%～80%的B液20 min左右，80%～100%的B液0.5 min，最后使用100%B液洗脫5 min(B液為0.1 ml/dl甲酸的乙腈溶液)。質譜儀在正離子模式下運行，氣源溫度為325℃，源氣流量為11 L/min。每種代謝物的裂解電壓在130～175 V范圍內，保留時間固定為50 ms，電子倍增器電壓為400 V。

1.4 統計學分析 運用 SPSS11.0統計軟件對數據進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。健康人群按年齡和性別分組，分別計算各組代謝物的均值與標準差，應用方差分析比較不同年齡段對數據的影響。相關分析采用Pearson檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。主成分分析(PCA)和PLS使用AMIX軟件。非參數Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗使用Dunn的多重比較測試應用于數據。

2 實驗結果

2.1 質譜分析 本研究分為兩部分，質譜分析和預測準確率。所有尿液樣品來自不同的病人和對照組。主要是通過NMR分析了來自15例患者和15例健康人的尿代謝組，并進行了主成分分析(PCA)檢驗，繼續運用液相色譜-三重四極桿質譜法分析來自另外16例CKD患者和15例對照的尿液樣本進行驗證。來自CKD患者的31例尿樣和健康受試者通過1H NMR分析。根據圖譜的峰值對每個樣品進行PCA和偏最小二乘分析，結果顯示各組患者代謝物的差異與年齡、藥物、性別或樣本無關，而主要是與CKD有關。因此，在探索階段運用NMR技術鑒定了29種代謝物可以作為鑒定CKD的潛在生物標志，并且每種代謝物在所有募集者中全部被檢測到。為了進一步評估29種代謝物在評價和預測CKD的有效性，實驗采用了更高分辨率的技術，即選擇反應監測(selected reaction monitoring，SRM)技術，對得到的結果進行定量分析見表1。表1顯示這七種尿代謝物在CKD患者和正常人中存在顯著的差異，其中明顯與CKD相關性的是谷氨酸、胍基乙酸酯、α-苯乙酰谷氨酰胺和N-氧化三甲胺(在CKD中均增加)，以及5-羥脯氨酸、牛磺酸和枸櫞酸鹽(在CKD中均降低)。

表1在CKD和非CKD患者中有顯著差異變化的數據

代謝物CKD+ vs 對照變化值P值 CKD- vs 對照變化值P值枸櫞酸鹽鳥苷酸乙酸酯牛磺酸N-氧化三甲胺谷氨酸α-苯乙酰谷氨酰胺5-羥脯氨酸0.025 87.5490.4364.242.4531.7340.1440.000 20.000 60.0240.000 40.000 50.000 60.000 2 0.0936.002 50.5933.4232.111.8360.1660.000 90.000 10.034 30.000 20.000 10.007 10.000 1

2.2 預測準確率 本研究中利用質譜分析結合選擇反應監測技術，鑒定了CKD患者正常人尿液中有七種代謝物具有顯著性差異，根據檢測這些代謝物的變化趨勢能夠判斷是否患有CKD。為了驗證這些代謝物在鑒定CKD患者中的作用，本研究進行了盲性實驗。通過募集CKD患者和正常人，檢測他們尿液中這七種代謝物的含量，預測他們是否為CKD患者或者正常人。實驗結果顯示，根據對所收集樣本的代謝物分析發現，5例CKD患者中有4例被鑒定為CKD患者(80%準確性)，7例健康人中有6例被劃分到對照區(86%準確性)。這些結果說明本研究中鑒定的七種代謝物谷氨酸、胍基乙酸酯、α-苯乙酰谷氨酰胺、N-氧化三甲胺、枸櫞酸鹽、5-羥脯氨酸和牛磺酸作為鑒定CKD的生物標志物具有較高的可靠性。

3 討論

目前，我國CKD發病率呈升高趨勢，其原因是缺乏特異度高的早期診斷方法。過去用來檢測CKD患者主要是通過檢測eGFR和蛋白尿的含量。但是eGFR受肌肉質量、年齡、種族和早期評估的影響，并不能十分準確地反映出CKD患者進展階段。盡管后來的研究鑒定了如中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C也與CKD進展有關，但是這些研究僅僅建立在非常有限的研究對象基礎上，而且不同的研究中采用的診斷標準及方法也會造成診斷效能評估等結果的差異。質譜檢測技術可以大規模高通量篩選代謝物，具有高特異度和靈敏度，且可將傳統方法檢測不到的化合物檢出。然后，再用LC-MS技術將患者和正常人的質譜圖進行定量分析，以鑒定盡可能多的具有差異的代謝物信息和鑒定新的生物標志物。其優勢在于：能夠直接檢測分析患者的原始樣品，靈敏度高，特異度好，所需樣品數量少；分析簡便，高通量大規模篩選；結果可靠，重復性好。在本研究中，通過質譜檢測對比CKD晚期階段(3～5期)患者和健康志愿者的尿液代謝物，發現了CKD患者尿代謝物中有七種代謝物可以明顯表征CKD。

根據文獻報道幾型腎臟損傷中轉錄組數據顯示5-羥脯氨酸酶上升22%，而γ-谷氨酰轉移酶的表達降低[7]，這些數據變化與本研究中顯示的數據一致，在CKD患者尿液中5-羥基脯氨酸降低而谷氨酸升高。苯乙酰谷氨酰胺在肝臟和腎臟中由苯乙酸酯和谷氨酰胺合成并通過尿液排泄體外。苯基丁酸酯和苯乙酸酯在患有尿素循環障礙的患者被用作氮循環的替代途徑，因此苯乙酰谷氨酰胺作為有效的替代載體可以降低這些患者的氮水平[8]。在CKD患者中，由于腎臟功能下降導致尿素積累，這可以解釋在CKD患者中苯乙酰谷氨酰胺的增加，作為氮排泄的補償機制。牛磺酸能偶促進一些離子的轉運如鈉離子、鉀離子、鈣離子和鎂離子，有研究表明在高血壓和腎衰竭患者血漿中的牛磺酸降低，這也與本實驗發現CKD患者中低牛磺酸相一致[9]。N-氧化三甲胺在腎衰竭患者中上升，在本研究中同樣發現在CKD患者中N-氧化三甲胺上升[10]。由于腎功能下降導致尿素和胍增加，而N-氧化三甲胺是機體用來抵消這些物質。實驗中發現CKD患者中枸櫞酸鹽水平降低[11]。與前人的發現一致。此外，幾種代謝紊亂與低枸櫞酸鹽相關，包括腎小管pH或細胞內pH降低，例如CKD患者特別是晚期階段存在的代謝性酸中毒[12]。

此外，利用本研究中鑒定的其中代謝物預測CKD患者和正常人，其中CKD患者準確性達到80%，正常人的準確性高達86%，僅僅只有兩例預測錯誤。表明這7種生物標志物不僅僅可以用于正常人CKD的診斷，更具有意義的是可準確判斷CKD。因此，我們認為本研究中鑒定的7種代謝物可以作為判定CKD的標志物，有助于識別和監測CKD的進展階段。