六種國產糞便隱血檢測試劑的診斷性能評價*

李文東，白海燕，李淑蓮，林惠玲，諶泰春，徐士蘭，張惠林

(1.廈門市湖里區婦幼保健院，福建廈門 361006；2.廈門大學附屬中山醫院，福建廈門 361004)

糞便隱血是指消化道出血，紅細胞已被消化破壞，肉眼和顯微鏡下均不能證實的出血[1]。常見糞便隱血檢測方法根據檢測原理不同有化學法和免疫法兩種定性檢測法，各有其優點和不足[2]。化學法(如匹拉米洞法、鄰甲苯胺法、還原酚酞法等)易受食物、藥物等干擾因素的影響；免疫法(如酶聯免疫吸附法、膠體金免疫層析法等)敏感度高、特異性好，不受食物因素的影響，無需禁食[3]，但可能因血紅蛋白變性而出現假陰性結果[4]。目前國內外尚無標準化的糞便隱血試驗的性能評估方法，面對性能指標信息有限、品種繁多和應用廣泛的糞便隱血試劑，臨床醫生與檢驗人員充滿困惑與迷茫。本研究綜合評價六種臨床常用國產商品化糞便隱血試劑的檢測性能，包括最低檢測限、分析特異性(包括交叉反應性和干擾物質)和高濃度血紅蛋白檢測能力等，為探討糞便隱血試劑的性能評估方法提供借鑒，并為臨床實驗室選擇合適的糞便隱血試劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 臨床糞便樣本：120例新鮮糞便樣本來自廈門大學附屬中山醫院消化內科就診患者，包括消化道出血53例，男性33例，女性20例，中位年齡56.60±14.62歲；消化道腫瘤67例，男性46例，女性21例，中位年齡59.76±11.45歲。另有80例新鮮糞便標本來自健康體檢者，其中男性54例，女性26例，中位年齡57.76±13.40歲。采用清潔干燥不吸水帶蓋容器采集新鮮糞便標本，立即送檢，于收集后1 h內完成檢測。所有樣本的使用均經醫院倫理委員會批準，并獲得患者本人的知情同意，簽署知情同意書。

1.1.2 最低檢測限樣本：采用無菌蒸餾水將40 mg/ml的人血紅蛋白(批號F16062401，廈門市波生生物技術有限公司提供)稀釋至25，50，75，100，150，200，400和1 000 ng/ml等8個濃度。所有樣本均在使用前臨時配制，確?，F配現用。

1.1.3 高值血紅蛋白樣本：用無菌蒸餾水將40 mg/ml的人血紅蛋白(批號F16062401，廈門市波生生物技術有限公司提供)稀釋至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20 mg/ml和40 mg/ml共12個濃度。所有樣本均在使用前臨時配制，確?，F配現用。

1.1.4 特異性試驗樣本：在200 ng/ml的血紅蛋白溶液中加入不同量的維生素C，使最后的維生素C濃度分別為0.01，0.05，0.1和0.3 mg/ml。所有樣本均在使用前臨時配制，確保現配現用。將牛、狗、雞、豬、羊以及兔的血紅蛋白分別配制成濃度為0.5 mg/ml的樣本，將辣根過氧化物酶(HRP)配制成2 mg/ml的樣本[5]。

1.2 試劑 六個國產糞便隱血檢測試劑的廠家包括：廈門市波生生物技術有限公司(膠體金法，批號為H17062401，簡稱波生)、艾博生物醫藥(杭州)有限公司(膠體金法，批號為2017030350，簡稱艾博)、英科新創(廈門)科技有限公司(膠體金法，批號為20170610，簡稱新創)、北京萬華普曼生物工程有限公司(金試紙條，批號為17070023，簡稱萬華)、廣州萬孚生物技術股份有限公司(免疫層析法，批號為W03070704S，簡稱萬孚)和珠海貝索生物技術有限公司(匹拉米洞半定量檢測法，批號為217041，簡稱貝索)。以上各種糞便隱血試劑均按照各試劑說明書妥善保存，嚴格按產品說明書操作并判斷結果。

1.3 方法

1.3.1 室內質量控制：每批檢測開始前檢測自制質控品，質控品結果為陽性才進行后續檢測。

1.3.2 樣本檢測：所有樣本(包括臨床樣本以及上述所有配制樣本)，均采用六種國產糞便隱血檢測試劑分別檢測，每個樣本重復檢測3次，操作方法嚴格按試劑說明書進行，記錄檢測結果。

1.4 統計學分析 六種國產糞便隱血試劑的就診患者和健康體檢人員的陽性率比較采用χ2檢驗，運用SPSS Statistics 20進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 六種國產糞便隱血檢測試劑最低檢測限比較 見表1。本研究采用六種國產糞便隱血試劑分別檢測不同濃度的人血紅蛋白溶液，化學法的檢測試劑(貝索)的最低檢測限為25 ng/ml，其它五種免疫法檢測試劑(艾博、波生、新創、萬華和萬孚)的檢測限分別為50，100，150，200和200 ng/ml。

表1 六種國產糞便隱血試劑最低檢測限

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

2.2 六種國產糞便隱血檢測試劑對高值血紅蛋白檢測高限比較 見表2。

表2六種國產糞便隱血試劑高濃度血紅蛋白檢測結果

血紅蛋白濃度(mg/ml)試劑廠家及檢測結果貝索波生艾博新創萬華萬孚123456789102040++++++++++++++++++++++--++++++++++--+++++++-----+++---------+++---------

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

貝索試劑(化學法)檢測40 mg/ml人血紅蛋白呈陽性，波生和艾博兩種便隱血試劑檢測人血紅蛋白高值為10 mg/ml，新創試劑可檢測人血紅蛋白高值為7 mg/ml，萬華和萬孚兩種試劑的檢測高值為3 mg/ml。除貝索試劑外，當血紅蛋白濃度高于各試劑檢測高值時，檢測結果呈陰性。

2.3 六種國產糞便隱血試劑檢測特異性分析 本研究也針對糞便隱血試劑的檢測特異性進行評估，分別測試動物血、辣根過氧化物酶和維生素C這三種干擾物質對糞便隱血試劑檢測結果的影響。待檢樣本中加入不同動物來源的血紅蛋白和辣根過氧化物酶干擾物質后，除貝索檢測六種500 μg/ml的動物血紅蛋白均呈陽性，萬孚和新創兩種糞便隱血試劑檢測500 μg/ml兔血紅蛋白樣本時出現陽性結果外，其余均不與牛、狗、雞、豬、羊和兔的血紅蛋白以及HRP發生交叉反應，見表3。

表3干擾因素下六種國產糞便隱血試劑的檢測結果

標本(μg/ml)檢測試劑貝索萬孚新創艾博波生萬華牛血(500)狗血(500)雞血(500)豬血(500)羊血(500)兔血(500)HRP(2000)++++++------+------+----------------------

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

維生素C是糞便隱血試驗假陰性結果的影響因素，在我們的實驗中，200 ng/ml血紅蛋白樣本中維生素C含量在0.01～0.3 mg/ml范圍，波生、萬孚、貝索和艾博四種試劑檢測結果不變；而新創和萬華兩種糞便隱血試劑在維生素C含量高于0.1 mg/ml時，檢測結果改變，結果由陽性變為陰性。提示維生素C含量高于0.1 mg/ml時將導致新創和萬華檢測試劑出現假陰性結果，見表4。

表4維生素C對六種國產糞便隱血試劑的影響

試劑廠家維生素C濃度(mg/ml)及檢測結果00.010.050.10.3波生萬孚貝索艾博新創萬華++++++++++++++++++++++--++++--

注：“-”為陰性，“+”為陽性。

2.4 六種國產糞便隱血試劑臨床標本檢測結果 采用六種國產糞便隱血試劑分別檢測120例消化內科就診患者(試驗組)和80例健康體檢人員(對照組)新鮮糞便標本，檢測結果見表5。120例消化內科患者的六種試劑陽性率在23.3%～60.0%區間，依次為貝索60.0%，艾博46.7%，波生42.5%，新創40.0%，萬華33.3%和萬孚23.3%。統計學分析顯示試驗組六種方法的檢測陽性率之間差異有統計學意義(P<0.05)；80例健康體檢者的檢測陽性率在1.3%～2.5%之間，統計學分析顯示對照組六種方法的檢測陽性率之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 六種國產糞便隱血試劑臨床標本檢測結果比較

3 討論

糞便隱血試驗對消化道出血的診斷有重要價值，現在常作為消化道惡性腫瘤早期診斷的一個篩選指標[6～8]。與確診消化道出血的金標準消化道內窺鏡檢查相比，糞便隱血試驗具有非侵入性、標本留取方便、檢測快速、成本低廉等優勢而容易被患者接受[9，10]。目前市面上用于糞便隱血檢測的方法主要是化學法和免疫法，無論是化學法或免疫法檢測試劑，在臨床應用前都需要對廠家聲明的性能參數進行驗證，至少應包括：檢出限、符合率，如為定量方法應驗證精密度(包括重復性和中間精密度)[11]。本項目對六種國產糞便隱血試劑，包括五種免疫法試劑和一種化學法檢測試劑進行了檢出限評價?；瘜W法試劑(貝索)的最低檢測限為25 ng/ml，五種免疫法試劑(艾博、波生、新創、萬華和萬孚)的檢測限分別為50，100，150，200和200 ng/ml，六種試劑的最低檢測限均符合各廠家的最低檢測限聲明。目前的隱血檢測方法敏感度高，胃腸道少量出血可檢出陽性結果，有研究發現牙齦出血也可能致糞便隱血陽性[2，12]，因此對于無癥狀患者陽性結果解釋需慎重，必要時進行隨訪復查。

化學法糞便隱血試劑是基于血紅蛋白具有過氧化物酶活性的測定方法，以匹拉米洞方法為代表，利用匹拉米洞為呈色指示劑，在酸及過氧化氫溶液作用下，與血紅蛋白作用，產生紫藍而后呈現紫紅的顏色。此法特異性差，無法區分血紅蛋白來源于消化道出血或來源于食物，甚至有些藥物的使用也會影響檢測結果。而免疫法糞便隱血試劑，主要是檢測人體血紅蛋白抗原，具有較強的特異性和靈敏性，一般不受食物和藥物等因素的影響，基于這種優勢，免疫法采用抗人血紅蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，特異地與糞便中人血紅蛋白結合，利用膠體金等標記進行顯色測定，已廣泛應用于臨床。但也有不足之處，可能因血紅蛋白變性或降解而產生假陰性結果[4，13]。本研究分別研究動物血(牛、狗、雞、豬、羊和兔)、辣根過氧化物酶和維生素C三類常見的干擾物質對糞便隱血試劑檢測人血紅蛋白的影響。貝索試劑(化學法)在檢測不同動物(牛、狗、雞、豬、羊和兔)來源的血紅蛋白時均產生假陽性結果。萬孚和新創兩種糞便隱血試劑檢測500 μg/ml的兔血紅蛋白樣本時出現陽性結果，但對HRP檢測無反應，波生、萬華和艾博三種糞便隱血試劑對500 μg/ml的牛、狗、雞、豬、羊和兔的血紅蛋白以及HRP檢測無反應。對于抗維生素C的干擾能力，波生、萬孚、貝索、艾博的試劑優于萬華和新創。

糞便隱血試驗是臨床糞便常規檢測中的一個重要的檢測項目，廣泛應用于消化道、胃腸道病變等內科疾病的診斷中，對消化道出血的診斷具有極其重要的價值[14]。如何選擇高性能的糞便隱血試驗，是臨床和檢驗人員共同關注的問題。本文平行對比分析六種檢測方法在臨床中的應用，結果顯示，六種方法的檢測陽性率在23.3%～60.0%，其差異較大(P<0.05)。即使同為免疫法試劑，其檢測陽性率也有差異(23.3%～46.7%)。診斷試劑所選用的抗體、試劑的稀釋液和試劑制作工藝不同，都會影響試劑的性能[3]。即使是同一個基因工程抗原，用在不同的公司產品中，其特異性也可能不同，這是目前基因工程抗原用于實驗診斷的最大問題。因此，為了提高診斷試劑檢測的質量，開展由衛生主管部門主導的實驗室室間質量控制，提升解決不同產品檢測靈敏性差異較大的短板，是非常重要的[15]。建議選用某種診斷試劑產品前應該做好臨床評估，建立可溯源性的診斷試劑定量檢測體系。

本研究存在一定的局限性，首先是我們僅對六種糞便隱血試劑一個批次的產品進行性能評估，不能反映不同批次的產品性能。此外，本研究納入的臨床糞便樣本，并未全部進行消化道出血的金標準內窺鏡檢查，因此無法評估其診斷效能，包括檢測敏感度和特異度。而且，本研究也僅對同一批樣本的陽性率進行了比較，未對不符合的樣本進行追蹤。目前臨床檢驗中心尚未開展糞便隱血的實驗室室間質評，市面上沒有相關的糞便隱血的標準品用于質量控制，實驗室多采用自制的質控品用于日常工作的質量控制[2]，本研究也僅采用人血紅蛋白來檢測試劑的最低檢測限和最高值血紅蛋白檢測能力，有條件時增加與標準物質比較的結果，建立主管部門牽頭的完善質量評估體系，將是解決當前糞便隱血試劑質量良莠不齊的當務之急。