急性早幼粒細胞白血病相關融合基因的研究進展

張 靜，張 卓，周 晉

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液內科，哈爾濱 150001)

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓系白血病中具有獨特形態(tài)學和細胞遺傳學特征的一種類型，臨床以嚴重的出凝血障礙為特征。APL誘導分化治療有效，是急性髓系白血病中預后最好的一種亞型，形態(tài)學上屬于急性髓系白血病M3型，占急性髓系白血病的10%～15%[1]。APL患者中90%以上的分子生物學特征為第15號染色體長臂2區(qū)2帶上的早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein, PML)基因和第17號染色體長臂2區(qū)1帶上的視黃酸受體(retinoic acid receptor, RAR)α相互異位產生新的PML-RARα融合基因，該融合基因編碼PML-RARα融合蛋白[2]。PML-RARα融合蛋白通過抑制轉錄的方式阻止細胞分化，導致髓系細胞分化障礙并停滯在早幼粒細胞階段。PML-RARα是APL發(fā)病的分子細胞遺傳學基礎，是APL的關鍵驅動突變，具有顯性負性調控作用，影響髓系分化、增殖、凋亡及DNA復制和修復[3]。同時，PML-RARα融合基因還是全反式視黃酸與砷劑靶向治療APL的靶點。除PML-RARα融合基因外，APL的相關融合基因還包括核有絲分裂器蛋白(nuclear mitotic apparatus protein，NuMA)-RARα、早幼粒細胞白血病鋅指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger protein，PLZF)-RARα、信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)5B-RARα和核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)-RARα等。它們均涉及第17號染色體上的RARα基因斷裂，斷裂點位于RARα基因的第2內含子中，導致RARα結構發(fā)生異常[4]。APL是臨床上第一個針對腫瘤特異性標志分子應用誘導分化進行治療并取得良好治療效果的人類惡性腫瘤[5]。現(xiàn)就APL相關融合基因的研究進展予以綜述。

1 PML-RARα融合基因

PML基因長約35 kb，含有9個外顯子。其蛋白的N端區(qū)域含有3個小泛素化分子1修飾位點，在正常細胞中，泛素化的PML蛋白定位于蛋白核小體內，而蛋白核小體呈粗點狀分布于細胞核內，未泛素化的PML蛋白定位于細胞質[6]。PML蛋白是一種腫瘤生長抑制因子，其參與髓系細胞的終末分化。與純合性缺失PML小鼠相比，表達PML的轉基因小鼠的APL發(fā)病率明顯降低，且純合性缺失PML基因小鼠外周血的成熟粒細胞數(shù)目顯著低于正常小鼠[7]。同時，PML通過分別募集組蛋白乙酰化轉移酶和組蛋白去乙酰化酶至靶基因使其組蛋白乙酰化或去乙酰化，導致靶基因處于轉錄激活或轉錄靜止狀態(tài)。此外，PML蛋白還可能通過與Fas死亡結構域相關蛋白的相互作用而誘導Fas依賴的細胞凋亡[8]。

視黃酸是體內維生素A的代謝中間產物，視黃酸類藥物包括全反式視黃酸、13-順式視黃酸和9-順式視黃酸等多種同分異構體。視黃酸類受體包括視黃酸受體和類視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)兩種，分別有α、β和γ 3種亞型。其中，RARα位于細胞核內，屬于類固醇激素受體家族成員。視黃酸與RARα結合后，通過調控基因轉錄進而影響細胞的增殖和分化。RARα功能區(qū)含有轉錄激活結構域、DNA結合區(qū)、核定位相關區(qū)和配體結合相關區(qū)[9]。視黃酸受體作為配體誘導的轉錄因子形成視黃酸受體/RXR異二聚體，與視黃酸反應元件結合啟動下游分化相關基因的轉錄[10]。

PML-RARα融合基因是第15號染色體的PML基因斷裂，第17號染色體上的RARα基因斷裂后，通過互換和易位形成[11]。RARα基因是一種視黃酸依賴性轉錄激活因子，它在前體細胞的誘導分化中起重要作用。而PML-RARα與RARα功能不同，其阻斷了粒細胞的分化成熟[12]。由于PML斷裂位點位置不同，而RARα的斷裂位點恒定在第2內含子，故依據(jù)PML上斷裂位點的不同，PML-RARα融合基因表達產物能形成3種異構體，即PML基因的第6外顯子(斷裂點在6內含子內)與RARα第3外顯子結合形成長型(L型)PML-RARα融合基因(約占56%)，PML第3外顯子(斷裂點在3內含子內)與RARα第3外顯子結合形成短型(S型)PML-RARα融合基因(約占40%)，PML第6外顯子(斷裂點在6外顯子中)與RARα的第3外顯子結合形成變異型(V型)PML-RARα融合基因(約占4%)[13]。每種PML-RARα融合基因表達產物均包含PML的DNA結構域。這些結構域通過顯性負抑制作用使細胞的分化凋亡受阻。研究發(fā)現(xiàn)，全反式視黃酸作用于PML-RARα融合基因的RARα在轉錄基因水平誘導APL細胞分化成熟，而三氧化二砷作用于APL在轉錄后修飾和蛋白質水平發(fā)揮誘導細胞凋亡和降解PML-RARα融合基因表達產物的作用[14]。可見，全反式視黃酸和三氧化二砷在誘導APL細胞分化、凋亡和降解PML-RARα融合基因表達產物方面存在一定的協(xié)同作用[15]。全反式視黃酸能增強三氧化二砷介導的RXRα磷酸化，從而協(xié)同誘導凋亡[16]。

PML-RARα融合蛋白既能下調核酸適配子的表達，又能募集甲基化酶使靶基因異常甲基化，從而干擾正常細胞分化，引起APL的發(fā)生和發(fā)展。正常PML蛋白以不連續(xù)點狀形式分布于核體結構中，是核體的組成成分。而在APL細胞中，由于PML-RARα未被小泛素化分子1修飾不能定位于核體中，導致核體結構破壞，故使PML-RARα融合蛋白散在分布于細胞核呈微小斑點，抑制PML正常活性，從而干擾細胞正常分化與凋亡[17]。同時，PML-RARα融合蛋白也通過異常招募組蛋白去乙酰酶和甲基化酶，增加共抑制復合物和視黃酸靶基因啟動子甲基化，從而使RAR基因沉默。因此，PML-RARα融合基因陽性APL對全反式視黃酸敏感[18]。

PML-RARα融合蛋白與轉錄抑制因子及組蛋白去乙酰化酶的結合率遠高于RARα蛋白，其結合可抑制RARα蛋白的翻譯和轉錄。視黃酸與PML-RARα融合蛋白中的RARα結合后，一方面可引起PML-RARα融合蛋白構象改變，釋放抑制性復合物，結合轉錄輔助激活因子，促進DNA翻譯和轉錄[19]。另一方面視黃酸作用于PML-RARα融合蛋白，通過泛素-蛋白酶體途徑和胱天蛋白酶途徑降解PML-RARα融合蛋白，使PML與RARα分離，PML和RARα功能恢復，從而使早幼粒細胞重新分化[20]。三氧化二砷作用于PML-RARα融合蛋白的PML區(qū)域，導致PML小泛素化分子修飾，泛素化的PML能夠招募泛素連接酶環(huán)指蛋白4，形成聚泛素化的PML-RARα。聚泛素化的PML-RARα可以通過泛素-蛋白酶體途徑被降解，并解除表達產物對PML或RARα正常功能的抑制，從而解除APL細胞的分化阻滯[21]。且三氧化二砷在血藥濃度較高時(>0.5 μmol/L)促進凋亡，在血藥濃度較低(0.25～0.5 μmol/L)時誘導分化[22]。此外，雷帕霉素通過提高細胞自噬促進全反式視黃酸降解PML-RARα融合蛋白，而抑制自噬可減少PML-RARα降解。研究顯示，砷劑和雄黃等可以增強APL細胞的自噬水平，促進PML-RARα融合蛋白降解及髓系白血病中性粒細胞分化[23]。

2 其他APL變異易位X-RARα融合基因

2.1PLZF-RARα融合基因 PLZF結構包括BTB/POZ(pox virus and zinc finger protein)結構域、第二結構域和C2H2樣鋅指結構域3個功能區(qū)。PLZF具有參與神經(jīng)系統(tǒng)和胚胎骨骼系統(tǒng)發(fā)育、抑制干細胞分化和阻礙細胞生長等作用。其只有定位在細胞核才具有轉錄調節(jié)功能[24]。PLZF-RARα融合基因是由位于第11號染色體長臂2區(qū)3帶的PLZF與第17號染色體長臂2區(qū)1帶的RARα相結合形成。PLZF-RARα融合蛋白與RAR競爭結合視黃酸反應元件和RXR，干擾RARα/RXR信號轉導，且通過輔助抑制分子募集與BTB/POZ結合形成復合物，抑制粒細胞生長分化因子表達。因此，PLZF-RARα融合基因陽性APL對全反式視黃酸耐藥[25]。

2.2NPM-RARα融合基因 NPM基因位于第5號染色體長臂3區(qū)5帶，含有12個外顯子。NPM具有N端低聚域、組蛋白結合中間域和C端核酸結合域3個功能結構域。其中，N端低聚域涉及分子伴侶活性和核輸出信號。NPM核仁定位信號區(qū)域在C端，NPM在調節(jié)中心體復制和核糖體生物合成等方面具有重要作用，其過表達可導致p53、MDM2(mouse double minute 2 homolog)和p21蛋白表達上調。急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展與NPM異常突變密切相關。NPM通過染色體易位、促進相關癌基因表達和異常的細胞質定位而誘發(fā)急性髓系白血病[26]。NPM-RARα融合基因是由t(5; 17)(q35; q21)易位形成，其保留了NPM的二聚體形成區(qū)和DNA連接區(qū)，RARα保留了配體結合區(qū)、DNA連接區(qū)和二聚體形成區(qū)。NPM-RARα形成二聚體結合視黃酸反應元件，從而競爭抑制野生型RARα功能，使造血細胞分化阻滯在未成熟階段[27]。

2.3NuMA-RARα融合基因 NuMA基因位于第11號染色體長臂1區(qū)3帶，全長77.7 kb。其在哺乳動物細胞中表達豐度較高，能編碼分子量約為240 000的蛋白質。NuMA主要包含一個球形頭部N端，中間為非連續(xù)卷曲和一個球形尾部C端。NuMA是一些自身免疫患者的自身抗原，其過表達會誘導多極紡錘體形成，引起細胞分裂異常[28]。NuMA功能涉及細胞周期調控、細胞凋亡、細胞分裂、胚胎移植和腫瘤發(fā)生等。在APL細胞中，t(11; 17)(q13; q21)易位導致NuMA與RARα形成融合基因。NuMA-RARα融合蛋白能與RXR相互作用形成異二聚體，競爭抑制野生型RARα功能[29]。

2.4STAT5B-RARα融合基因 STAT5B基因位于第17號染色體長臂1區(qū)1帶2亞帶，由19個外顯子組成，在造血細胞生長、增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。STAT5B-RARα融合基因是由RARα的3號外顯子與STAT5B的15外顯子融合，保留了部分RARα的反式激活域和STAT5B的酪氨酸活化結構域[30]。STAT5B-RARα融合基因競爭性結合RXR和酪氨酸激酶受體，干擾RARα和STAT信號轉導，形成異常的轉錄因子調控造血系統(tǒng)。STAT5B-RARα融合基因陽性APL表現(xiàn)為視黃酸及亞砷酸耐藥[31]。

2.5cAMP依賴性蛋白激酶Ⅰα調節(jié)亞基(cAMP-dependent protein kinase type Ⅰ-alpha regulatory subunit, PRKAR1A)-RARα融合基因 PRKAR1A基因位于第17號常染色體長臂2區(qū)4帶2亞帶，總長約130 kb，含有11個外顯子，其中10個外顯子存在編碼區(qū)，編碼區(qū)域長1 143 bp。PRKAR1A廣泛表達于全身各個組織，是蛋白激酶A的重要調節(jié)亞基，它能負性調節(jié)蛋白激酶A活性。PRKAR1A是一個抑癌基因，其突變或表達下調會導致多種腫瘤的發(fā)生[32]。PRKAR1A-RARα融合蛋白可競爭性結合RXR，阻斷核內環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A信號轉導通路，阻止粒細胞分化為成熟粒細胞[33]。

2.6FIP1L1(factor interacting with PAPOLA and CPSF1)-RARα融合基因 FIP1L1基因位于第4號染色體上，含有19個外顯子。FIP1L1是一個完整的剪切亞基和聚腺苷酸化因子，其可與多聚腺苷酸聚合酶相互作用誘導多腺苷酸化。目前，F(xiàn)IP1L1基因通常與血小板衍生生長因子受體融合，激活酪氨酸激酶，進而促進嗜酸粒細胞增殖[34]。FIP1L1第15個外顯子與RARα的第3個外顯子結合形成FIP1L1-RARα融合基因，其二聚體可競爭性結合RXR，導致APL病理過程的發(fā)生[35]。

2.7B細胞淋巴瘤因子6共抑制因子(B-cell lymphoma 6 co-repressor，BCOR)-RARα融合基因 BCOR基因位于X染色體短臂1區(qū)1帶4亞帶，含有19個外顯子，是腫瘤抑制基因。BCOR蛋白選擇性與原癌蛋白Bcl-6的POZ結構域結合，是Bcl-6的共抑制因子。組織特異性Ⅰ類和Ⅱ類組蛋白去乙酰化酶與BCOR相互作用，抑制組蛋白去乙酰化酶下游基因轉錄[36]。t(X; 17)(p11; q12)易位形成的BCOR-RARα融合基因，易與RXR形成BCOR-RARα/RXRα復合體，此復合體可競爭性與視黃酸反應元件結合降低視黃酸的轉錄活性[37]。

2.8寡核苷酸結合折疊區(qū)2A(oligonucleotide binding fold containing 2A, OBFC2A)-RARα融合基因 OBFC2A基因位于第2號染色體長臂3區(qū)2帶3亞帶，編碼人單鏈DNA結合蛋白2。而單鏈DNA結合蛋白2在DNA損傷反應和基因組穩(wěn)定性中具有重要作用。OBFC2A的第5外顯子與RARα的第3外顯子融合形成OBFC2A-RARα融合基因。其中，OBFC2A編碼結合蛋白SOSS異源三聚體的支鏈，通過DNA損傷反應通路保持基因組穩(wěn)定。另外，PML也通過同源重組支持DNA雙鏈斷裂的修復。OBF2CA蛋白有一個N端寡核苷酸結合褶能結合單鏈DNA底物，結合褶連接一個不飽和富含甘氨酸的尾區(qū)。在大多數(shù)情況下，這個尾區(qū)在融合蛋白中刪除，但結合褶保留。因此，OBFC2A與RARα可能形成二聚體融合蛋白[38]。OBFC2A-RARα二聚體競爭性與視黃酸反應元件結合促使APL形成[39]。

2.9轉導素β樣1X連鎖受體1(transducin β-like 1X-linked receptor 1, TBLR1)-RARα融合基因 TBLR1基因位于第3號染色體長臂2區(qū)6帶，從酵母到人TBLR1均具有相似的結構和功能，是一個結構和功能保守的基因，含有16個外顯子。TBLR1的信使RNA長度為1 548 bp，編碼514個氨基酸的蛋白質。TBLR1蛋白包含3個結構域，包括C端的WD40重復結構域、N端的LiSH及一個F-box結構域。WD40結構域具有形成β-螺旋結構的功能，可為蛋白質之間相互作用提供支架。LiSH對半衰期和亞細胞定位有重要作用。F-box結構域具有募集泛素/19S蛋白酶體復合物的作用，從而介導轉錄抑制復合物和轉錄激活復合物之間的轉換。TBLR1參與Wnt信號通路、Notch信號通路、核因子κB信號通路。其第5外顯子與RARα的第3外顯子融合形成TBLR1-RARα融合基因[40]。TBLR1-RARα融合蛋白可通過募集更多的NCoR/SMRT轉錄抑制復合物，減弱RARα介導的靶基因轉錄激活作用，TBLR1-RARα對視黃酸敏感，其機制可能與全反式視黃酸降解TBLR1-RARα融合蛋白有關[41]。

2.10GTF2H2(general transcription factor Ⅱ H subunit 2)-RARα融合基因 GTF2H2基因位于第7號染色體長臂1區(qū)1帶2亞帶3次亞帶區(qū)域，由細胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶和核心TF2H組成。細胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶由3個亞基組成，主要作用為磷酸化RNA PolⅡ大亞基的C端結構域參與信使RNA的轉錄。核心TF2H由7個亞基組成。其中，著色性干皮病B組和著色性干皮病D組亞基通過核苷酸切除修復變形受損的雙螺旋，在TF2H參與的各種調控機制中起關鍵作用。TF2H結構高度保守，其對信使RNA轉錄的調控是通過參與RNA PolⅡ大亞基C端結構域的動態(tài)磷酸化而實現(xiàn)。TF2H在轉錄的起始、延伸、終止中具有重要作用。在細胞周期進程中，細胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶也發(fā)揮重要作用，是癌癥治療的新靶點[42]。GTF2H2-RARα融合基因是由t(7; 17)(q11; q21)易位形成。GTF2H2-RARα通過二聚體對RARα/RXR起負顯性抑制作用，其介導的GTF2I信號通路抑制是APL發(fā)病的機制之一。GTF2I-RARα陽性APL對視黃酸不敏感[43]。

2.11干擾素調節(jié)因子2結合蛋白2(interferon regulatory factor 2 binding protein 2, IRF2BP2)-RARα融合基 IRF2BP2基因位于第1號染色體長臂2帶3亞帶，IRF2BP2蛋白由571個氨基酸構成。IRF2BP2蛋白包含C端指環(huán)結構域和氨基端鋅指結構域兩個結構域，其中指環(huán)結構域包括一些轉錄共抑制因子，充當E2和E3泛素連接酶的橋梁，在介導蛋白與蛋白之間起重要作用。鋅指結構域主要存在于蛋白質的DNA結合結構域，與靶基因啟動子結合。IRF2BP2是p53的靶基因，作為p53的轉錄共抑制因子，IRF2BP2對p53的下游分子Bcl-2相關X蛋白具有抑制作用。其能在轉錄水平抑制造血主要調節(jié)因子LIM結構域結合蛋白1復合物，因此能對紅細胞的分化起調節(jié)作用[44]。IRF2BP2蛋白對活化的T細胞核因子具有抑制作用，進而調節(jié)細胞周期、分化、凋亡相關基因的表達。IRF2BP2-RARα融合基因由t(1; 17)(q42; q21)易位形成，通過負顯性抑制而誘導APL發(fā)生。IRF2BP2-RARα融合基因陽性APL對視黃酸和砷劑敏感[45]。

3 小 結

19～20世紀，腫瘤根治術和將化學治療整合于根治術(輔助化療)是惡性腫瘤治療出現(xiàn)的兩次飛躍，而分子靶向治療在腫瘤治療中具有里程碑和革命性的意義。APL是針對腫瘤特異性生物學行為治療而治愈的第一種人類惡性腫瘤，APL相關融合基因在其發(fā)生、發(fā)展及治療中發(fā)揮極為重要的作用。PML-RARα融合基因的發(fā)現(xiàn)極大地提髙了對APL發(fā)病分子生物學機制的認識。目前，對APL的研究多與PML-RARα相關，且PML-RARα的特殊結構也使以其為靶標的全反式視黃酸和三氧化二砷成為臨床上最常用的兩個有效藥物。砷劑和全反式視黃酸分別靶向PML-RARα導致PML和RARα降解，使APL治愈。未來，應更深入地了解APL相關融合基因的發(fā)生和功能機制，以更好地誘導其降解。