DNA損傷修復在肝細胞癌發生發展及治療過程中的作用

余 良，宋瑞鵬，孟凡征，劉連新

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院肝臟外科，哈爾濱 150001)

肝細胞癌(hepatocarcinoma,HCC)是源自肝細胞的原發性肝癌，占所有原發性肝癌的85%～90%，是男性的第五大常見癌癥，也是世界上女性的第七大常見癌癥[1]。估計每年新發病例數約為78.2萬例，每年造成60萬人死亡，其病死率高和生存時間短導致嚴重的全球健康負擔[1]。HCC的發生是遺傳以及環境因素相互作用的復雜過程，其機制尚未完全闡明，重要的危險因素包含慢性病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉毒素等環境毒素，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、飲酒、吸煙和飲食因素等生活方式因素[2]。各種HCC相關的風險因子能夠造成DNA損傷，損傷的DNA若未及時正確修復可導致基因改變和基因組不穩定，被逐漸認為是人類HCC的共同特征。DNA損傷修復過程失調與肝癌易感性相關，并且該過程在HCC細胞中往往增強，導致針對HCC細胞的抗癌治療效果不甚理想[3]。現就DNA損傷修復在HCC發生、發展及治療過程中的作用進行綜述。

1 DNA的損傷修復過程

DNA損傷修復的失調是HCC發生、發展的重要機制。在肝細胞內，從最基礎結構的堿基損傷到磷酸二酯鍵的斷裂，構成DNA的結構都可能發生損傷，包括堿基突變、核苷酸缺失、插入、雙鏈斷裂等[4]。外源性理化因素，機體正常代謝活動中產生的活性氧和活性氮，甚至機體自發的水解反應都可能造成DNA損傷[5]。正常生物體有相對完善的DNA損傷修復機制來修復由各種原因引起的DNA損傷，為了避免DNA損傷導致潛在的突變情況，細胞會通過某些反應修復損傷或激活程序性凋亡：①修復DNA損傷并恢復DNA雙鏈連續性；②激活DNA損傷檢查點，阻止細胞周期進展，以避免受損染色體的復制；③轉錄反應；④細胞凋亡途徑，消除嚴重受損或嚴重失調的細胞。DNA損傷修復方式包括核苷酸切除修復、堿基切除修復、同源重組修復、錯配修復。損傷發生時，細胞內損傷受體如毛細血管擴張性共濟失調突變蛋白(ataxia telangiectasia-mutated protein，ATM)和Rad3相關蛋白以及Rad9-Rad1-Hus1蛋白質復合體等率先進行DNA損傷檢測，隨即啟動檢驗點激酶1和2以及細胞周期調控因子的信號轉導級聯反應；后者進而通過激活p53并抑制細胞周期依賴性激酶實現G1、S、G2/M期細胞周期阻滯，使細胞在成功修復后得以重新進入細胞周期。一旦細胞中的DNA無法被修復，此時細胞就會進入凋亡通路，引導細胞進行自我凋亡，以防止DNA的相關損傷向子代進行傳遞[6]。

2 肝癌致病因素與DNA損傷修復

目前肝癌的病因尚未完全明確，隨著分子生物學技術的發展，分子層面對肝癌的致病機制進行了深入研究，初步揭示了各種肝癌的致病因素(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、膽汁酸、黃曲霉菌素等)在不同水平上造成不同程度的DNA損傷，尤其是在修復過程中一些潛在的致癌機制及重要基因不斷出現。

2.1乙型肝炎病毒與DNA損傷修復 慢性乙型肝炎病毒感染顯著增加了HCC的發生風險，其編碼的乙型肝炎病毒X蛋白是一種長度為154個氨基酸的蛋白質，在轉錄水平的反式激活病毒基因表達中具有重要作用[7]。Na等[8]研究發現，乙型肝炎病毒X蛋白通過與聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶1的相互作用抑制DNA修復復合物向受損DNA位點的募集，從而抑制DNA損傷的修復，可能導致肝癌發生。Martin-Lluesma等[9]發現乙型肝炎病毒X蛋白與DNA損傷結合蛋白1結合,干擾S期進程導致染色體分離缺陷，形成異常的有絲分裂紡錘體和多核細胞，促進肝癌的產生，解釋了乙型肝炎病毒引起的HCC染色體異常率高于其他致病因子的原因。與線粒體相關的乙型肝炎病毒X蛋白可誘導肝細胞氧化應激，產生豐富的活性氧誘導氧化性DNA損傷并導致8-羥基-2-脫氧鳥苷蓄積，可能是乙型肝炎病毒X蛋白的致癌機制[10]。研究表明[11],乙型肝炎病毒X蛋白最初誘導DNA損傷，然后破壞核酸代謝，進而阻止DNA修復并誘導HCC的發生,但其完整機制仍在探索中。

2.2丙型肝炎病毒與DNA損傷修復 丙型肝炎病毒屬于RNA病毒，現全球約有1.7億人感染[12]。丙型肝炎病毒感染是肝癌已廣泛證實的重要致病因素。丙型肝炎病毒可導致氧化應激水平升高，增加DNA損傷的發生。Machida等[12]研究發現丙型肝炎病毒核心和非結構蛋白3的表達激活誘導型一氧化氮合酶基因導致細胞DNA中一氧化氮的產生增加和DNA雙鏈斷裂的形成，但E1蛋白的表達不通過產生一氧化氮而增加DNA雙鏈斷裂。隨后的研究表明丙型肝炎病毒感染導致線粒體膜電位降低和活性氧水平的增加，核心蛋白、E1蛋白和非結構蛋白3的個體化表達能夠誘導活性氧進而導致DNA雙鏈斷裂增加[13]。Shawki等[14]的單細胞凝膠電泳實驗結果顯示，丙型肝炎病毒誘導的HCC和肝硬化患者外周血淋巴細胞的DNA損傷程度較高，出現DNA損傷的患者患肝癌的風險是無DNA損傷者的3.6倍。Pham等[15]研究發現丙型肝炎病毒下調泛素結合酶E2S的表達阻止非結構蛋白5A的蛋白酶體降解，使宿主細胞對DNA損傷更加敏感，該途徑可能是丙型肝炎病毒誘導的肝臟發病機制。Higgs等[16]發現丙型肝炎病毒感染后Gadd45beta表達下調，Gadd45beta啟動子的高甲基化是造成這種缺陷的原因。其下調導致異常的細胞周期停滯并減少DNA切除修復。在肝臟中丙型肝炎病毒感染和復制并不均勻并且存在個體肝細胞差異,Wang等[17]發現低丙型肝炎病毒載量的谷胱甘肽過氧化物酶2、減數分裂重組蛋白11、磷酸化ATM和8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶發生表達上調的現象，高載量者反而下調，而在輻射下低載量者中表現出更強的存活能力。這一反常結果的原因可能是細胞內病毒載量驅動細胞DNA損傷水平但抑制了與損傷相關的基因表達，尚不排除來自高載量細胞的活性氧的影響。這些發現為丙型肝炎病毒感染細胞中不同病毒載量引起的不同DNA損傷和修復反應提供了新的見解，并有待深入探索。

2.3黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)與DNA損傷修復 飲食中AFB1暴露是肝癌發生的主要危險因素，Weng等[18]發現超過60%的AFB1相關的HCC攜帶p53密碼子249突變，在AFB1的兩種反應途徑中，脂質過氧化途徑占絕對優勢，并對核苷酸切除修復、堿基切除修復和錯配修復產生抑制作用，導致肝細胞突變敏感性增加。Yao等[19]在一項納入1 486例HCC患者和1 996名對照者的對照研究發現，與對照組相比，AFB1暴露組和修復基因突變組HCC風險均增加，并且通過交互分析得出兩者可能存在相互作用。微囊藻毒素-LR(L:亮氨酸，R:精氨酸)與AFB1常共存于溫濕地區的污染食物和水中，同為致癌毒素。Liu等[20]的研究發現，同時暴露于微囊藻毒素-LR與AFB1的人肝細胞系HL7702發生了堿基切除修復基因脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1的表達上調，與單獨暴露于等量的AFB1或微囊藻毒素-LR相比，表現出顯著增加的DNA損傷。此外在無AFB1暴露的情況下，微囊藻毒素-LR可顯著下調堿基切除修復基因8-氧鳥嘌呤糖基化酶1的表達從而抑制損傷修復，但其具體機制及修復蛋白活性的變化情況有待進一步闡明。

2.4膽汁酸與DNA損傷修復 膽汁酸主要由肝細胞合成分泌，是肝臟微環境的組成部分，影響著細胞信號轉導并調節抗細胞凋亡基因的表達和細胞增殖[21]。甘氨鵝脫氧膽酸鈉(glycochenodeoxycholate，GCDA)是膽汁酸中的重要代謝成分，具有毒性和疏水性。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，在多種腫瘤中高表達。Zhou等[22]發現肝癌細胞中GCDA作用于環狀結構的Ser70位點使Bcl-2磷酸化，激活其抗凋亡作用，是GCDA誘導肝癌細胞耐藥的機制。Mcl-1是Bcl-2家族中的重要抗凋亡成員，在約50%的HCC患者中過表達，提示Mcl-1是一種潛在的治療靶點[23]。Liao等[23]發現GCDA于T163位點磷酸化Mcl-1，使其與泛素連接酶解離，增強了Mcl-1的抗凋亡功能，導致肝癌細胞長期存活或耐藥。Yu等[24]提出GCDA抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶并促進Mcl-1在細胞核中積累阻礙堿基切除修復過程，亦證明MCL-1是GCDA誘導HCC過程中的重要因子。

2.5NAFLD與DNA損傷修復 NAFLD是發達國家慢性肝病的最常見原因，波及其1/3人口總數。非酒精性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是NAFLD疾病譜的重要組成疾病，以肝細胞損傷和炎癥為特征，且可能發展為HCC[25]。近年來提出的機制為“多重打擊”假說，這些打擊包括胰島素抵抗，來源于腸道微生物群和脂肪組織的脂肪細胞因子等[26]。Gentric等[27]發現NASH患者肝臟中多倍體單核細胞數量增加，并伴有氧化應激介導的G2/M期DNA損傷檢查點的激活和緩慢的S/G2細胞周期進展。NAFLD小鼠模型中抗氧化劑治療阻止了多倍體的發展，支持了調控活性氧水平可以預防疾病進展的觀點。在酒精性肝損傷的活性氧中，細胞色素P450 2E1的誘導起主要作用[28]，這也可能是NAFLD中活性氧導致損傷的機制。研究發現，NASH患者肝臟中細胞色素P450 2E1的表達增加，表明細胞色素P450 2E1與NAFLD患者肝臟中活性氧的產生有關，但具體機制尚未明確[29]。Seki等[30]發現NAFLD患者的脂質過氧化標記8-羥脫氧鳥苷的水平增加，而少見于正常肝臟。Tanaka等[31]發現，與無HCC的NASH相比，由NASH進展的HCC中8-羥脫氧鳥苷陽性肝細胞的比例顯著增加。總之，這些數據表明氧化性DNA損傷隨著NASH進展而增加。值得注意的是，Fujita等[32]報道在鐵還原療法后，NASH患者肝臟中8-羥脫氧鳥苷水平顯著降低。因此，鐵過載可能是NASH患者氧化性DNA損傷的重要原因。

3 HCC的治療與DNA損傷修復

化學藥物治療幾乎是大多數無手術必要的晚期HCC患者的唯一選擇，并且HCC對大多數化療方案表現不同程度的耐藥性，導致可用于HCC的化療藥物較少。因此，迫切需要對HCC化療耐藥進行深入研究并開發新的化療策略。許多常規的化療藥物通過誘導HCC細胞DNA雙鏈斷裂而發揮作用，HCC細胞通過強化其非同源末端鏈接活性來抵消由化療藥物造成的DNA損傷，常導致其化療耐藥。Yang和Wang[33]研究發現HCC患者的X線修復交叉互補基因4組改變率低，但在經導管肝動脈化療栓塞術治療后X線修復交叉互補基因4表達增加。臨床上，X線修復交叉互補基因4的高水平表達與晚期HCC較低的總體存活率顯著相關，表明敲除X線修復交叉互補基因4的體外和異種移植腫瘤模型對化學治療敏感，X線修復交叉互補基因4促進癌細胞非同源末端鏈接活性，因此抑制X線修復交叉互補基因4表達的靶向藥物可以通過抑制DNA修復水平增強化學藥物的敏感性，可成為常規化療的有效輔助用藥。DNA依賴蛋白激酶催化亞基是非同源末端鏈接的核心組件，抑制DNA依賴蛋白激酶催化亞基活性使HCC細胞對DNA雙鏈斷裂修復減弱。肝癌的各種組織學分型中，HCC的DNA依賴蛋白激酶催化亞基表達的陽性比率最高[34]。DNA依賴蛋白激酶催化亞基不僅可以保護腫瘤細胞免受來自微環境或化學治療藥物治療的有害DNA損傷，而且還具有獨立于其DNA修復活性的額外特性，是治療HCC的潛在靶點[35]。Chen等[36]研究發現褪黑素誘導長鏈非編碼RNA Rad51-AS1的表達，降低HCC細胞的DNA修復能力，動物模型中進一步證實，與單一療法相比，依托泊苷聯合褪黑素抑制腫瘤生長效果增強。褪黑激素除抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力外，還抑制其DNA修復能力，從而增強放化療的細胞毒性，是潛在的輔助治療。微RNA(microRNA,miRNA/miR)的表達在腫瘤抑制中起作用，Luo等[37]研究發現過表達的miR-146a-5p通過激活DNA修復途徑和下調復制蛋白A基因，有助于抑制細胞增殖和增強放射敏感性，使HCC發生凋亡，miR-142-5p的進一步大規模研究有助于為HCC尋找新的有效治療途徑。Al-Hrout等[38]對藏紅花醛在HCC中的治療機制進行深入探索， 在體外實驗和生物模擬實驗中，通過內質網的應激，誘導DNA雙鏈斷裂并抑制DNA修復，使HCC細胞發生凋亡，這是首次關于藏紅花醛在DNA損傷修復途徑中作用的研究報道。帕布昔利布是一種口服細胞周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑，可有效治療乳腺癌。Huang等[39]評估了帕布昔利布聯合放療治療人類HCC的效果，ATM激酶是放療誘導的DNA雙鏈斷裂的關鍵上游激酶，帕布昔利布通過蛋白磷酸酶5介導對ATM的抑制作用。體外和體內研究均顯示，該過程是帕布昔利布和放療協同產生的，提供了一種新的聯合治療HCC策略，但其臨床試驗尚未開展。伊立替康在Ⅱ期臨床試驗中表現出的劑量依賴性毒性限制了其在HCC治療中的應用。Shao等[40]發現在HCC細胞系中吉非替尼與伊立替康的活性代謝物SN-38聯合顯示出協同活性，并且吉非替尼加SN-38誘導的細胞凋亡增強是胱天蛋白酶途徑激活的結果。從機制上分析，吉非替尼顯著促進Radbi蛋白的泛素-蛋白酶體依賴性降解，抑制DNA修復，引起更多DNA損傷，并最終導致這兩種藥物的協同作用。此外，在HepG2異種移植小鼠模型中進一步驗證了吉非替尼聯合伊立替康增加的抗腫瘤功效。這表明重組酶Rad51是一種有前景的靶標，并為研究拓撲異構酶Ⅰ抑制劑和吉非替尼聯合治療HCC的臨床試驗提供了理論基礎。

4 小 結

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、AFB1、NAFLD都可能導致DNA損傷，經過長時間積累后可能導致HCC的發生，各種致病因素對應著潛在的DNA損傷機制并可能存在不同層次的相互作用。DNA損傷修復不僅是HCC發生、發展的重要機制，也是化療及其他治療方式效果欠佳的重要原因。目前，醫學界對作用于DNA損傷修復的治療手段開展了許多相關研究，一些相關的基因片段已被準確定位，相關的治療方案也逐漸被提出，并取得了一些效果。但肝癌中DNA損傷修復的致癌機制仍有待研究，化學藥物治療方案的改良和創新前景廣闊，值得深入探索。