齲病微生態改善療法的研究進展

孫婧宇，李艷紅

(昆明醫科大學附屬口腔醫院口腔預防科，昆明 650106)

齲病是最常見的口腔疾病之一，是一種由口腔內多種因素復合作用于牙齒硬組織而導致的慢性進行性疾病，發病率高，分布廣泛。世界衛生組織已將齲病與癌癥以及心血管疾病并列為人類三大重點防治疾病。數百萬年來，微生物和人體通過相互適應和功能整合構建了一個完整的“超級有機體”[1]。這一進化過程產生了一個高度選擇、多樣化的口腔微生物群[2]。大約有700種口腔細菌已被鑒定出來，其中50%尚未被培養出，有些僅通過DNA序列發現。口腔微生物群與宿主相互作用、相互依賴，在微生態環境中共同構成微生態系統[3]。早在1994年Marsh等[4]就提出了“生態菌斑學說”，即口腔微生態系統通過能量流動、物質循環以及基因傳遞保持口腔微生態的動態穩定。然而，當微生態環境中關鍵因素改變，致使某些條件致病菌競爭性生長，口腔穩態被打破，原有的低致齲菌群轉化為高致齲菌群，導致齲病發生。微生態改善治療是指通過促進有益菌、抑制致病菌生長和繁殖使口腔微生態重新恢復平衡的治療方法[5]。現就齲病微生態的主要研究方法和微生態改善療法的研究進展予以綜述。

1 口腔微生物研究方法

從病因學來說，齲病是口腔微生態失衡導致的疾病。因此，齲病的研究必須從口腔微生態開始。口腔是人體中最復雜、最活躍、最多樣的微生物聚集地之一，也是公認的最古老的微生態系統。口腔微生物群易于取樣，是人類研究最多的微生物群，一般可作為微生物學研究模型。對口腔微生態進行研究有助于更清晰地闡明口腔微生態中各細菌相互作用的機制，并有助于研究治療和預防齲病的潛在途徑。口腔微生物研究方法是進行口腔微生態研究的基礎，研究方法的不斷改進也為微生態研究提供了便利和依據。

細菌的分離培養一直是口腔微生物研究的基礎。但因口腔是一個開放的生態系統，細菌的數量和種類受外界環境影響，且大量細菌無法培養，所以到目前為止仍有1/3～1/2的口腔微生物尚未被培養出來[6]。近年來，得益于現代分子生物學和生物化學的發展，口腔微生物群的組成和結構逐漸被學者所了解。口腔微生物群的研究方法有很多種，其中最主要的是傳統平板分離培養法和現代分子生物學法。

1.1傳統平板分離培養法 傳統平板分離培養法是采集唾液、齦溝液或牙菌斑等樣本后，在實驗室將樣本進行稀釋、接種和培養，隨后對培養出的菌落進行形態學觀察、分離純化以及生理生化鑒定。

據估計，地球上99%以上的細菌尚未在實驗室培養出來[6]。現在已經分離、培養、鑒定、描述和分類了約350種人類口腔中定植的細菌，但仍有50%的口腔細菌無法在實驗室培養[7]。口腔內細菌的培養需要不同的條件，如培養環境、培養溫度、化學培養基、細胞因子等。盡管目前實驗室已盡可能地滿足這些條件，但很多口腔細菌仍然無法以常規的方式培養出來，可能是因為它們與其他有機體有特殊的代謝聯系[8]。除此之外，缺乏某些特殊營養素或生長因子、培養基毒性、細菌感應以及其他信號系統的破壞或其他未知原因也導致許多菌種無法在體外進行培養。口腔細菌并不是孤立地生活在生物膜的復雜群落中，它們之間具有協同和拮抗作用，相互依賴得以生長和生存[9]。傳統平板分離培養法在揭示口腔微生物組的多樣性方面具有明顯的局限性，已漸漸無法滿足口腔微生物群組成和結構研究的需求，但其在微生物的分類及鑒定中仍非常重要。

1.2現代分子生物學分析方法 現代分子生物學是一種可以直接對環境微生物進行分析，通過檢測和分析從微生物群落中提取的核酸或蛋白質，實現對微生物群落多樣性和功能性的研究。目前常用的現代分子生物學分析方法主要有熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)和高通量測序技術。

FISH是一種核酸探針雜交技術。基本原理是將帶有熒光標記的探針與特異的互補序列雜交，通過對激發熒光信號進行檢測以鑒定和定量分析特異性微生物[10]。激光掃描共聚焦顯微鏡常與FISH結合用于研究完整的生物膜，以提高對微生物群落空間關系及其變化的分析能力。使用FISH和激光掃描共聚焦顯微鏡可以從剩余牙菌斑生物膜厚度、不同層面菌斑圖像、三維立體結構、死菌和活菌的數量及百分比、細菌活性等方面觀察牙菌斑的變化[11]。

高通量測序技術即新一代測序技術，是測定DNA分子中核苷酸精確順序的方法，其特點是通量高、耗費小，可一次進行幾百萬條單獨DNA分子的測序，且無需提前克隆及圖譜制作。新一代高通量測序技術為認識微生物群落的結構及功能、組成及豐度等的差異等起到了重要作用[5]。李瑩和儀虹[12]采集10例無齲和10例高齲受試者的唾液樣本，提取樣本細菌總基因組DNA，然后進行16 Sr DNA的聚合酶鏈反應擴增和454焦磷酸測序,結果顯示，不同個體之間唾液菌群結構差異較大，高齲組較無齲組有更高的微生物多樣性，但兩組擁有共同的核心微生物。該研究認為，齲病不是由某些特定致病微生物造成的，而是口腔微生物群落結構的多樣性及其變化導致的。

2 齲病的微生態改善療法

生態菌斑假說是為解釋齲病的病因而提出的，其總結了口腔微生態環境的動態變化。研究發現，很多口腔疾病是由口腔微生態失調引起的，并且口腔疾病也會引起微生物環境的改變[4]。目前已經認識到采用合適的方法調整口腔菌群平衡是預防和治療各種口腔疾病的關鍵，同時提出了微生態改善治療。微生態改善治療的目標是恢復微生態的平衡，目前主要用于胃腸道疾病的治療和預防。微生態改善治療從針對特定物種到替換整個微生物區系都有涉及。目前針對口腔微生態的改善療法主要有免疫策略、益生菌療法以及中藥防齲。

2.1免疫策略 早在19世紀60年代，國外學者就開始了防齲疫苗的研究，期望通過接種某種防齲疫苗以阻止致齲菌在口腔中的黏附和定植，達到調節口腔微生態平衡、預防齲病的目的[13]。齲病的免疫學預防主要分為主動免疫防齲和被動免疫防齲。主動免疫是將抗原性物質人工接種到機體上，刺激機體免疫系統產生免疫應答，以提高機體的抗病能力。主動免疫防齲方法主要有全菌細胞抗原免疫、重組細菌抗原免疫、抗原分子免疫等。被動免疫是指給機體輸注外源性免疫效應物質、致敏淋巴細胞后獲得的特異性免疫能力。被動免疫防齲方法主要有轉基因植物免疫、多克隆抗體、單克隆抗體防齲等。

1993年，Parkash等[14]對171例兒童的患齲情況與細胞介導的免疫應答情況進行了研究。收集研究對象的淋巴細胞進行體外培養，用變異鏈球菌作為抗原刺激物觀察淋巴細胞的變形程度，得出刺激指數。結果顯示，與高齲兒童相比，低齲兒童刺激指數較高；在齲病的不同階段，細胞介導的免疫應答具有調節保護作用。Simón-Soro等[15]利用熒光標記和流式細胞術標記特異性抗體發現，免疫球蛋白A是影響齲病危險性的重要因素，患齲唾液與無齲唾液中免疫球蛋白A的比例比較差異有統計學意義。唾液抗體和其他保護性成分對牙釉質的免疫應答發揮重要保護作用。

在預防齲病方面，被動免疫和主動免疫均取得了較好的效果，但這些方法僅是以變異鏈球菌的表面抗原為基礎[16]。研究證實，齲洞內的微生物群落具有高度多樣性，變異鏈球菌在整個齲洞微生物群落中所占的比例不到1%[17]。此外，與齲病有關的微生物群落存在較大的個體差異，即使是同一個體不同齲損區的細菌活躍性也有較大差異[18]。因此，單一物種或單個表面抗原用于主動和被動免疫具有一定的局限性[19]。此外，全菌細胞抗變異鏈球菌抗體可與機體某些組織蛋白發生交叉反應，從而產生免疫復合物介導的疾病，如細菌性心內膜炎。變異鏈球菌與其他口腔鏈球菌有交叉反應性抗原,所以防齲疫苗介導的免疫反應可能會破壞口腔正常菌群的生態平衡[20]。

2.2益生菌療法 益生菌是一種當給予足夠劑量時有益于宿主健康的活的微生物[21]。益生菌療法是指用益生菌替代病原微生物，以恢復微生態平衡的方法[22]，目前多用于防治消化系統的菌群失調。口腔是消化系統的起始端，齲病是一種口腔菌群失調導致的疾病。有學者提出，將益生菌療法運用于口腔可達到預防齲病的目的[23]。乳桿菌和雙歧桿菌是最主要的兩種益生菌，對鏈球菌和念珠菌的生長有抑制作用[24]，作用機制包括改變口腔內pH，產生抗菌化合物對抗病原體，競爭病原體結合和受體位點，刺激免疫調節細胞產生免疫反應等。Aminabadi等[25]給予105名兒童含有鼠李糖乳桿菌GG株的酸奶后，口腔致齲菌的數量明顯下降。Jindal等[26]的研究證明，食用益生菌片劑可使變異鏈球菌的數目顯著下降。但也有學者認為，益生菌對致齲菌無抑制作用，有些益生菌甚至會加速齲病進程[27]。一項隨機雙盲對照試驗發現，干酪乳桿菌F19對變異鏈球菌等致齲菌無抑制作用，且干酪乳桿菌F19也未在口腔中定植[28]。Cildir等[29]發現，兒童服用羅伊乳桿菌后致齲菌變異鏈球菌和乳酸桿菌的數量并未減少。Schwendicke等[30]通過體外實驗發現，鼠李糖乳桿菌不但不能抑制變異鏈球菌的生長,反而誘導牙本質脫礦加速，導致齲病加重。

近年來一些口腔新物種被分離出來，包括鏈球菌A12[31]和S.dalsani[32]，其兼具抗菌和抗酸的功能。這些口腔微生物較傳統乳制品或腸道相關益生菌更佳，雖然在口腔中的定植能力有限，但能發揮更多潛在的有益功能。因此，接種這些潛在的有益的口腔微生物或通過使用刺激其生長和有益功能的益生元以調節口腔微生態平衡的研究受到越來越多的關注，目前正在進行臨床試驗以研究其在人體口腔中的定植能力和改善口腔健康方面的效果。

除上述益生菌外，益生元對調節口腔微生態平衡也有一定的作用。精氨酸是一種合適的益生元。臨床研究表明，在牙膏中添加適量精氨酸可顯著改善有低度到中度齲病風險人群的患齲情況[33]。在體外實驗中，精氨酸對口腔微生態的調節具有積極作用[34]。目前關于其他益生元對口腔健康的潛在作用的研究依然非常有限。

2.3中藥防齲 使用中藥預防齲病是當前研究的熱點。中藥預防齲病的機制主要有兩方面：①對牙體組織再礦化的作用；②抑制致齲菌黏附，影響牙菌斑生物膜的結構。

動物研究發現，五倍子可有效抑制變異鏈球菌在細菌生物膜中的生長，抑制菌斑中致齲微生物的活性[35]。厚樸酚可以抑制變異鏈球菌的黏附、生長以及產酸，還可影響細菌生物膜的結構和致齲菌的活性[36]。茶葉中具有防齲作用的成分是茶多酚。茶多酚可抑制致齲菌生長，減少變異鏈球菌附著，降低變異鏈球菌葡糖基轉移酶的活性，可有效調節口腔微生態平衡[37]。除此之外，白芨、黃苓、丁香、大黃、虎杖、檸檬、蜂膠等均具有不同程度的抑制致齲菌黏附、生長、產酸的作用[38]。但以上研究多在體外進行，在體內，尤其是在復雜的口腔微生態環境中，中藥是否還可以發揮調節微生態平衡的作用尚無結論。

3 小 結

近年來，使用現代分子生物學分析技術和顯微鏡技術的口腔微生態研究受研究成本和檢測方法的限制，通常樣本數量較少，導致這些研究有很大的局限性。隨著研究方法的不斷改進，口腔微生態的多組學研究也得到長足的發展。目前大部分的口腔微生物研究都集中在細菌多樣性上，忽視了口腔中真菌和病毒對口腔微生態的調節作用[39]。未來應加強對病毒和真菌在口腔中作用的研究。

在臨床實踐中，齲病的治療通常被理解為以恢復牙齒結構、功能和美學要求為基礎的牙體硬組織的修復。但這并不是對齲病本身的治療，而是對其后果的治療。此外，口腔微生物群具有個體差異性，患齲由遺傳和口腔微生態環境共同決定[40]。防齲的目標是采取相應的預防或治療措施調控影響齲病發生的多種因素，恢復口腔微生物穩態，進而控制齲病進展，恢復牙齒的結構和功能。研究表明，無論是免疫策略、益生菌療法還是中藥防齲都可以在一定程度上阻礙致齲菌的黏附、定植和生長，調節口腔微生態平衡，達到有效防齲的目的[41]。盡管防齲研究已取得了一些成果，但這些種方法均存在一定的缺陷，甚至有研究認為這些方法并不能達到防齲的目的，有時還會導致口腔微生態紊亂[6]。因此，尚需深入研究各種調節口腔微生態平衡的防齲方法的作用機制，并進行長期、大樣本的臨床試驗以觀察防齲方法的效果。