TK1及TWIST與老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者乳腺切除術后生存的關系分析

徐昕，呂勇剛，王磊，李信

空軍軍醫大學西京醫院（解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院）甲狀腺乳腺血管外科，西安 710032

乳腺癌是臨床上女性最常見的惡性腫瘤，威脅女性健康和生存[1-2]。已有的證據顯示，乳腺癌的發病率和病死率有逐年升高的趨勢[3]。乳腺癌的發病有一定的年齡偏向性，老年人是乳腺癌的高發人群，也是患者預后的重要因素[4]。胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是近年來新發現的細胞增殖相關生物大分子，其表達水平與惡性腫瘤細胞的多種病理過程相關，如增殖、分化、凋亡、轉移等，且可作為腫瘤早期發現、藥物療效評估及患者預后判斷的重要標志物[5]。扭曲蛋白TWIST也參與了多種惡性腫瘤的發生、發展的病理過程，也是潛在的惡性腫瘤藥物治療的重要靶點，也可作為判斷患者預后的參考標志物[6]。本研究分析TK1及TWIST與老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者術后生存的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院甲狀腺乳腺血管外科2011年2月至2016年12月診治的80例老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌并行乳腺切除術患者為研究對象。納入標準：所有患者均經病理學檢查確診，并符合中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范（2007版）[7]中關于老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌的診斷標準。排除標準：并發嚴重的代謝疾病患者；有嚴重的認知功能障礙患者；并發其他惡性腫瘤患者。將此80例患者設為淋巴結陽性組，年齡62～71歲，平均（65.5±9.2）歲；Ⅰ期25例，Ⅱ期30例，Ⅲ期25例。另選取同期健康體檢者80例設為對照組，老年腋窩淋巴結陰性乳腺癌患者80例設為淋巴結陰性組。3組患者平均年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所有納入的研究對象或其家屬均知情并簽署知情同意書，并經過醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑與方法

抽取空腹靜脈血，1000 r/min離心10 min后保存于4℃保藏箱待用。本研究中所有檢測項目均采用酶聯免疫吸附測定法進行。TK1蛋白酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Omega公司；Ki-67蛋白酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Abcam公司；惡性腫瘤相關物質群（tumor supplied group of factors，TSGF）蛋白酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司；TWIST蛋白酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Research and Developmen（tR&D）公司；缺氧誘導因子-1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）蛋白檢測試劑盒購自美國Santa Cruz公司；Dickkopf相關蛋白 1（Dickkopf-related protein 1，DKK1）酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Amresco公司。所有檢測的操作過程及操作條件均按照試劑盒說明書進行。

1.3 觀察指標

檢測各組血清中TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白水平，與β-actin的比值為蛋白相對表達水平。TK1/β-actin＜0.50為“+”，0.50≤TK1/β-actin≤0.55 為“++”，TK1/β-actin＞0.55 為“+++”；TWIST/β-actin＜0.50為“+”，0.50≤TWIST/β-actin≤0.60為“++”，TWIST/β-actin＞0.60為“+++”。

1.4 統計學分析

采用Graphpad Prism 5.0統計-軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，采用Log-rank法進行生存情況的比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及 DKK1蛋白相對表達水平的比較

將淋巴結陰性組+淋巴結陽性組設為乳腺癌組。乳腺癌組患者 TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；且淋巴結陽性組患者 TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及 DKK1蛋白相對表達水平均高于淋巴結陰性組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1、表2）

表1 對照組與乳腺癌組患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達水平的比較

表2 淋巴結陰性組與淋巴結陽性組患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達水平的比較

2.2 不同臨床分期的腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達水平的比較

不同臨床分期的腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨著患者臨床分期的增加，上述蛋白的相對表達水平增高（P＜0.05）。（表3）

2.3 不同TK1、TWIST水平的老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者的生存情況比較

隨著TK1、TWIST水平的升高，老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者的生存率逐漸降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1、圖2）

表3 不同臨床分期淋巴結陽性組患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達水平的比較

圖1 不同TK1水平的老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者的生存曲線

圖2 不同TWIST水平的老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者的生存曲線

3 討論

乳腺癌的發病率和病死率有逐年升高的趨勢，且是影響老年女性患者生活質量和生存狀態的重要因素。乳腺癌患者在臨床上通常采用乳腺癌切除術治療，且已經取得明顯的進展。探索乳腺癌患者乳腺癌切除術后生存的相關生物大分子標志物對臨床的早期診斷具有重要的參考意義。本研究在對TK1及TWIST與老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者乳腺切除術后生存的關系進行研究時發現，乳腺癌組TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達水平均高于對照組，且淋巴結陽性組高于淋巴結陰性組。TK1及TWIST表達情況與老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者乳腺切除術后的生存有關。

TK1是參與了多種惡性腫瘤發病過程的生物大分子，也是評價惡性腫瘤患者預后情況的重要標志物[7-8]。在分析尿路上皮腫瘤組織中TK1表達變化及意義的研究中發現，尿路上皮腫瘤組織中TK1表達上調，其表達變化有助于判斷尿路上皮腫瘤的病理分級[9]。以往的研究也發現替吉奧對晚期乳腺癌患者血清TK1、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）的調控作用是其提高患者生活質量，改善患者預后的關鍵[10]。以往的研究也發現血清TK1在胃癌、肺癌、結腸癌及健康人群中的表達存在明顯的差異，且與患者的臨床分期及預后密切相關[11]。同時，血清中細胞角質蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、TK1蛋白表達水平與肺癌復發呈明顯的正相關[12]。本研究發現TK1蛋白表達水平與老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌發病有密切的關系。在以往的研究中證實TK1、Ki-67及TSGF在惡性腫瘤的發病中有一定的相關性[13-14]，本課題組在以后的研究中將進一步分析3種蛋白在老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌發病及治療中的相關性，以期為臨床診斷提供更多的標志物。TWIST蛋白是惡性腫瘤惡化轉移的參與蛋白分子，也是評價臨床腫瘤藥物治療效果的重要標志物[15-16]。在研究轉錄因子TWIST基因慢病毒質粒構建及其促進乳腺癌上皮細胞MCF-7上皮-間充質轉化的過程中發現，TWIST蛋白參與了惡性腫瘤細胞的上皮-間充質轉化過程[17]，且膀胱腫瘤組織及尿液標本中TWIST基因的甲基化水平的異常也是膀胱腫瘤發病的重要因素[18]。在分析Twist表達與移行上皮腫瘤惡變及病理相關性的研究中也發現生物大分子Twist表達在移行細胞癌變過程中明顯升高,同時兩者共同參與移行細胞癌局部浸潤和淋巴結轉移[19]。以往的研究也證實TWIST與大多數的惡性腫瘤發生和發展關系密切，且TWIST基因甲基化是腫瘤發生的高危因素[20-21]。本研究發現TWIST水平越高的老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者的生存率越低。HIF-1α是細胞增殖過程中表達增強的關鍵蛋白，且與腫瘤患者的生存質量及生存期密切相關[22]，而DKK1也是腫瘤發生轉移的關鍵調節蛋白[23]，與本研究結論一致。雖然本研究中證實上述蛋白與患者臨床分期有關，但鑒于研究的樣本量相對較少，為獲得更準確可靠的結果，在下一步的研究中課題組將進一步增大研究樣本。因此，TK1及TWIST與老年腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者臨床分期有關，其水平與乳腺切除術后生存有關。