大血藤藥材三氯甲烷部位HPLC指紋圖譜研究

*

1.桂林醫學院，廣西 桂林 541004；2.菲鵬生物股份有限公司，廣東 東莞 523808

中藥大血藤為木通科大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv.)Rehd.et Wils..的干燥藤莖。大血藤味苦、平，歸大腸、肝經。具有清熱解毒、活血、祛風止痛等作用，可用以治療腸癰腹痛、熱毒瘡瘍、經閉痛經、風濕痹痛、跌打腫痛等[1]。中國藥典(2015年版)大血藤質量標準中并未對其所含的化學成分進行定量控制。據文獻報道[2～5]，大血藤中含有鞣質、糖苷類、環多酚類、三萜皂苷類、木質素類、黃酮類以及蒽醌類化學物質。而大黃素、大黃酚、綠原酸等物質具有較強的抗菌活性，這與其在腸癰腹痛、慢性盆腔炎中的臨床應用密切相關，為更有效地控制大血藤的內在質量，本實驗應用HPLC方法，建立了大血藤三氯甲烷部位HPLC指紋圖譜分析方法，為該藥材提供了更全面的質量控制依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20A型系列高效液相色譜儀(包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、色譜工作站，日本島津公司)；B2200S-T超聲清洗器(必能信超聲(上海)有限公司)；BT224S電子天平(德國Sartorius公司)；HH-S恒溫水浴鍋(金壇市恒豐儀器廠)；NW20超純水系統(力新儀器(上海)有限公司)。

1.2 材料 大黃素、大黃酚對照品(質量分數 ≥ 98%)由上海順勃生物工程技術有限公司提供；綠原酸對照品(批號：20110812，中國藥品生物制品檢定所)。乙腈、甲醇均為色譜純溶劑；水為超純水；氯仿、乙酸乙酯、鹽酸均為分析純。大血藤藥材信息見表1。

表1 10批大血藤藥材的詳細信息

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取一定量的綠原酸、大黃素、大黃酚對照品，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取約1.0 g的大血藤，精密稱定，加入50 mL甲醇回流1 h，趁熱抽濾，用少許甲醇洗藥渣及抽濾瓶，合并甲醇至圓底燒瓶中，將甲醇提取液旋蒸至近干，加入8% HCL10 mL，將酸液超聲10 min后再加入氯仿25 mL，回流30 min，將氯仿溶液轉移置分液漏斗中，靜置分層，取氯仿層溶液并再用15 mL氯仿萃取三次，合并氯仿層，旋蒸至近干，用甲醇定容至5 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Diamonsil spursil C18( 150×4.6 mm，5 μm)；流動相A為乙腈，B為水，梯度洗脫。柱溫：30 ℃；流速0.8 mL/min；檢測波長270 nm；進樣量為10 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2 HPLC指紋圖譜梯度洗脫條件

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按2.3中色譜條件注入液相色譜儀，連續進樣6次，選定指紋圖譜中3號共有峰為參照峰，在270 nm波長進行檢測，計算主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，主要共有峰的相對保留時間的RSD為0%～1.01%，相對峰面積的RSD為0%～2.37% ，結果表明，儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24、48、66、80、96 h，按2.3中色譜條件注入液相色譜儀，在270 nm波長進行檢測，計算主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，主要共有峰的相對保留時間的RSD為0%～1.21%，相對峰面積的RSD為0%～2.88%。結果表明，供試品溶液在96 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 按2.2項下“供試品溶液的制備”方法，同法制備六份，按上述色譜條件注入液相色譜儀，在270 nm波長進行檢測，計算主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，主要共有峰的相對保留時間的RSD為0%～1.98%，相對峰面積的RSD為0%～2.91%。結果表明重復性良好。

3 結果與分析

3.1 大血藤三氯甲烷部位指紋圖譜的建立與分析 按2.2項下“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，測定10批大血藤三氯甲烷部位的HPLC圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”軟件進行處理，得到10批藥材三氯甲烷部位在270 nm波長下的指紋圖譜圖(圖1)，經過譜峰多點校正后生成共有模式的對照指紋圖譜(圖3)，確定19個色譜峰為共有指紋峰。10批藥材的相似度在0.80～1.00之間，見表4。

表3 共有指紋峰相對保留時間

表4 共有指紋峰相對峰面積

3.2 峰的確認 根據已確認的 19 個共有峰，因6 號峰在各樣品中均存在，保留時間適中，為峰面積大的共有色譜峰，故選取 6 號峰為參照峰(S)。

表5 大血藤三氯甲烷部位指紋圖譜與共有模式相似度

3.3 大血藤三氯甲烷部位指紋圖譜分析 大血藤三氯甲烷部位共檢測到19個共有色譜峰，經與對照品的保留時間和紫外光譜對照，其中1、14、16號峰分別為綠原酸、大黃素和大黃酚。10批次大血藤藥材共有峰面積占總峰面積均大于90%。選定指紋圖譜中3號共有峰為參照物峰。以參照物峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，不同批次大血藤共有峰相對保留時間RSD小于3%，而相對保留峰面積RSD較大。由此可知，本實驗建立的色譜方法可以使不同批次大血藤藥材具有基本一致的色譜行為，但藥材之間各種化學成分的含量受多種因素的影響具有較大差異。

4 實驗討論

研究表明，大血藤中的綠原酸及蒽醌類成分具有抗菌消炎的功效，因而把大血藤中酚酸類及蒽醌類成分作為其指紋圖譜的目標成分。在供試品溶液的制備中，考察了以甲醇、乙醇為溶劑，采用回流提取、超聲提取、酸水解后氯仿提取等方案，實驗結果表明單純的醇提圖譜成分復雜，且極性成分較多，用C18柱難以實現較好的分離。考慮到蒽醌類成分在大血藤中以游離形式或苷類存在、蒽醌類物質的溶解性質，最終采用酸水解氯仿萃取的提取方法。徐鋒[6]等人進行了大血藤的HPLC指紋圖譜研究，建立大血藤的乙醇提取液的指紋圖譜。本實驗研究大血藤氯仿部位的HPLC指紋圖譜，確定19個色譜峰為共有指紋峰。10批藥材的相似度在0.80～1.00之間，指認了大黃素、大黃酚及綠原酸峰，這與大血藤臨床應用及藥理藥效更加契合。

本實驗通過比較大血藤三氯甲烷部位200 nm～500 nm HPLC色譜圖，發現270 nm下各峰分離良好，特征峰明顯且峰型較好，而且在此波長下，綠原酸、大黃素、大黃酚，這些指標成分都顯示了較好的色譜峰，故確定選擇270 nm作為指紋圖譜的檢測波長。