牙髓干細胞來源條件培養基促進組織修復與再生的研究進展

秦 杰，王曉春

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院口腔科，哈爾濱 150001)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不僅具有自我更新能力，還具有分化成多種細胞系的潛能，可從骨髓、脂肪組織、外周血、牙髓等成體組織以及胎盤、臍血、臍帶等圍生期組織中分離[1-3]。骨髓是臨床最常應用的MSCs來源，但采集過程痛苦且具有侵襲性，而牙髓的侵入性較低，逐漸成為MSCs的來源。牙髓為結締組織，是組織再生的最佳選擇。每個牙髓都可以提供大量的牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)，其獲取方便，且適合低溫保存。

MSCs的治療潛力在很大程度上取決于細胞外環境中分子和因子的釋放，包括具有旁分泌活性的可溶性因子(蛋白質、核酸、脂類)和胞外囊泡[4]。從骨髓間充質干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 中提取的可溶性因子在再生醫學中得到了廣泛的研究和應用。胞外囊泡也逐漸引起越來越多的關注，可分為凋亡體、微粒子和外泌體[5-6]。有證據表明，胞外囊泡主要負責MSCs的再生，并保留了其母細胞的歸巢特性[7]。DPSCs胞外囊泡主要存在于DPSCs條件培養基(conditioned medium，CM)中。現就DPSCs-CM促進組織修復與再生的研究進展予以綜述。

1 DPSCs

DPSCs具有高增殖潛能，可從附著于塑料培養皿的牙髓組織碎片中分離并擴增，并可在不中斷細胞增殖的情況下轉移到其他培養皿。人血小板提取物是臨床大規模制造擴增DPSCs的最佳生長補劑。目前，DPSCs的鑒定標準為：①具有依附性；②具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞的能力；③在體外表達間充質標志物(CD29、CD90、CD105、CD73和CD44)，但不表達造血譜系標志物(CD14、CD34、CD45)[8]。DPSCs屬于MSCs，可分化為神經外胚層細胞、脂肪細胞、成牙細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞等中胚層來源細胞，可見，DPSCs具有可塑性[3]。有研究證明，與BMSCs相比，DPSCs的增殖和礦化誘導能力較大[2]。因此，DPSCs在組織再生療法中的廣泛應用成為研究的熱點。

2 DPSCs-CM

DPSCs外環境中營養物質的釋放決定了其治療的潛能，其營養物質主要存在于CM中，主要包含大量的細胞因子、趨化因子、生長因子以及細胞外囊泡。與細胞治療相比，DPSCs-CM不僅可促進組織的修復與再生，還具有高特異性、無細胞毒性和低免疫原性的特點，彌補了細胞治療的缺陷，有望成為代替DPSCs的治療新手段。

2.1DPSCs-CM與牙齒組織損傷 齲病和牙髓病是常見的口腔疾病。對于不可逆性牙髓病主要采用根管治療術，其主要目的是去除和控制感染。但由于失去了牙髓組織的營養供應，根管治療術后的牙體組織變脆易導致牙體折裂，還可出現牙齒變色影響美觀等現象。因此，DPSCs-CM的作用顯得尤為重要。

DPSCs-CM可促進成纖維細胞、成肌細胞、DPSCs等細胞的增殖和遷移，其作用效果較BMSCs-CM和脂肪干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)-CM顯著[9-11]。Hayashi等[12]比較DPSCs-CM、BMSCs-CM和ASCs-CM的再生能力的研究發現，DPSCs-CM誘導再生組織的區域更多，再生區域的細胞密度更大，其促進作用可隨細胞微環境的變化而變化。Nakayama等[9]發現，經粒細胞集落刺激因子處理的DPSCs-CM對細胞遷移、免疫調節、抗凋亡、內皮分化和神經突延長均有較強的促進作用。化學試劑乙二胺四乙酸與DPSCs-CM結合可增強細胞增殖和遷移以及成牙細胞的分化能力，并強調了DPSCs-CM對成牙細胞分化的有益作用[10]。DPSCs-CM中高水平的細胞因子(如神經營養素-3和骨形態發生蛋白)的促進作用可以參與成牙細胞分化[13]。DPSCs向成牙細胞分化過程中，神經營養素-3的表達上調，可加速牙髓細胞的分化[14-15]。骨形態發生蛋白是發育過程的多效功能轉化生長因子，可促進成牙細胞分化[16]。Huang等[17]指出，體內DPSCs-CM對成牙細胞分化具有促進作用，尤其是DPSCs-CM中的外泌體。外泌體由DPSCs分泌，參與細胞間通訊以及受損組織的保護和再生[18]。對異位牙移植模型的研究發現，與單獨DPDCs誘導組相比，DPSCs-CM來源外泌體組的牙源性分化基因(牙本質涎磷蛋白)的表達更強烈[17]。綜上所述，與BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM在牙胚細胞分化方面的效率更高，為DPSCs-CM在牙組織再生方面的應用開辟了廣闊的前景。

2.2DPSCs-CM與血管疾病 新血管生成和缺血范圍是評估缺血類疾病危險性的主要因素。目前，治療缺血性疾病的方法較多，但尚未找到有效的治療方法。DPSCs-CM可以對內皮細胞和血管生成產生影響。有研究發現，與BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM的抗凋亡能力較強，此抗凋亡能力可應用于臍靜脈內皮細胞、成纖維細胞和肌細胞[9,19-20]。DPSCs-CM主要通過促進內皮細胞分化或管狀網絡形成來誘導肌細胞、臍靜脈內皮細胞和成纖維細胞等細胞的血管生成，這種血管生成的刺激主要與CM中血管生成因子[如單核細胞趨化因子-1、血管內皮生長因子、白細胞介素(interleukin，IL)-8、胰島素樣生長因子、基質金屬蛋白酶-3、粒細胞集落刺激因子]的存在有關[21-22]。將注射DPSCs-CM的離體牙根移植入裸鼠皮下的體內培養發現，與注射BMSCs-CM和ASCs-CM的離體牙組相比，DPSCs-CM可促進更多新生血管的形成[12]。Iohara等[19]的研究發現，DPSCs-CM可使大鼠后肢缺血區域的血流增加，并形成高密度血管。綜上所述，DPSCs-CM可促進血管新生和減少缺血，對心血管和缺血性疾病發揮積極作用。

2.3DPSCs-CM與骨關節疾病 肌肉骨骼和骨關節疾病可影響患者的日常生活，但目前尚未找到有效的治療方法[23]。關節炎癥疾病(如關節炎)的對癥治療(服用消炎藥物)會引起許多不良反應，DPSCs-CM所包含的調節炎癥環境的因子可有效治療關節炎癥。

體外DPSCs-CM可促進巨噬細胞極化表型轉換，使其處于M2型巨噬細胞抗炎狀態。在DPSCs-CM處理的細胞中，M1型巨噬細胞的特異性基因(如腫瘤壞死因子、IL-1、IL-6、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-9)表達下調，而M2型巨噬細胞的特異性基因(精氨酸酶-1和缺氧誘導分化因子-1)表達上調[24]。DPSCs-CM具有誘導抗炎環境的能力，可增加IL-10的表達[25]。此外，DPSCs-CM還具有成骨分化的潛能，可用于骨缺損(如骨不連)的再生。Alkharobi等[26]發現，DPSCs-CM中的生長因子可使DPSCs分化為成骨樣細胞，并檢測到胰島素樣生長因子結合蛋白-2和胰島素樣生長因子結合蛋白-3兩種特異性因子的存在。DPSCs分化為成骨樣細胞后，胰島素樣生長因子結合蛋白-2表達水平升高，而胰島素樣生長因子結合蛋白-3表達水平降低，可見，胰島素樣生長因子結合蛋白-2和胰島素樣生長因子結合蛋白-3以及DPSCs-CM均參與了DPSCs分化的調控。Ma等[27]通過細胞年齡對DPSCs-CM性能影響的研究發現，幼年DPSCs-CM誘導的成年供體DPSCs增殖增強，但成骨分化能力下降；而成年DPSCs-CM誘導的幼年供體DPSCs增殖減弱，但成骨分化能力增強。由此可見，DPSCs-CM對減少與骨關節疾病有關的組織破壞和誘導新的成骨組織形成有重要的作用，可為肌肉、骨骼和關節疾病的治療提供新的選擇。

2.4DPSCs-CM與神經疾病 神經系統疾病的種類很多，如神經退行性疾病(帕金森病、阿爾茨海默病)、周圍神經損傷、缺血性腦損傷等，但目前尚無有效的治療神經系統疾病的方法。一項體外研究發現，DPSCs-CM可誘導神經母細胞瘤細胞向神經元細胞分化，并招募神經元細胞，可將DPSCs-CM的治愈能力用于腦再生治療方法的開發[28]。

在阿爾茨海默病的體外模型中，DPSCs-CM通過抑制神經母細胞瘤細胞的凋亡，提高細胞活力，起到神經保護的作用[29]。DPSCs-CM可以使神經母細胞瘤細胞中B細胞淋巴瘤因子-2 (一種抗凋亡蛋白)的表達顯著升高，凋亡啟動子蛋白表達顯著降低。有研究發現，DPSCs-CM含有腦啡肽酶，能夠降解誘導細胞凋亡的β-淀粉樣肽[29]。與BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM中可以檢測到更多的神經保護因子、血管內皮生長因子和抗凋亡因子。DPSCs-CM提供的神經保護環境可為腦缺血提供神經保護治療。Song等[30]對缺氧缺血性腦損傷體外模型的研究發現，DPSCs-CM可通過減少反應性膠質化和促炎細胞因子(IL-1β)的表達，對星形膠質細胞起保護作用，但BMSCs-CM并未引起類似的結果。此外，DPSCs-CM可通過抑制IL-1β和激活IL-10的表達產生抗炎作用，并伴隨行為測試的顯著恢復，表明DPSCs-CM可改善損傷的腦部功能。周圍神經損傷的體外模型的研究也報道了DPSCs-CM的神經保護作用。Yamamoto等[31]對移植入DPSCs的大鼠坐骨神經缺損模型的研究發現，有髓纖維可在移植缺損處再生，但DPSCs并未直接分化為施萬細胞表型，而是在施萬細胞附近定位誘導多種營養因子(如腦源性神經營養因子、神經生長因子、胰島素樣生長因子、血管內皮生長因子)，營養因子使施萬細胞凋亡減少，促進軸突再生以及血管生成。Mead等[32]對視網膜神經損傷體外模型的研究顯示，與BMSCs-CM或ASCs-CM相比，DPSCs-CM可保護神經，并可促進由神經保護因子和促血管生成因子介導的神經生成。

綜上所述，與BMSCs-CM、ASCs-CM等相比，DPSCs-CM含有較多的神經保護因子和促血管生成因子。DPSCs-CM在阿爾茨海默病、帕金森病、缺氧缺血性腦損傷、周圍神經損傷等神經系統疾病的組織保護和再生中起主導作用，為神經損傷類疾病的治療提供了新的思路[29-30]。

2.5DPSCs-CM與實體器官衰竭 實體器官(肝臟或肺臟)衰竭可導致機體功能衰竭，常危及生命。衰竭器官的功能細胞由纖維化組織取代，并與炎癥反應相關，因此，抑制炎癥是治療的關鍵因素。

與BMSCs-CM相比，DPSCs-CM可以促進肝細胞增殖并清除慢性炎癥。丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶與肝功能顯著相關。與其他器官相比，丙氨酸轉氨酶在肝臟中表達水平更高，天冬氨酸轉氨酶與肝臟活動有關，而堿性磷酸酶與細胞增殖有關。血清丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶水平升高是肝細胞破膜釋放酶的重要標志。Kumar等[33]對DPSCs-CM和BMSCs-CM中丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶進行對比分析發現，3種酶在DPSCs-CM中的檢測結果較高，并可促進肝細胞增殖。DPSCs-CM可誘導抑制纖維化標志物(如α-平滑肌肌動蛋白)的表達，并可通過誘導巨噬細胞促炎表型向抗炎表型轉化來減少纖維化，同時還可抑制促炎細胞因子(如腫瘤壞死因子-α、IL-1β)的表達，進一步促進了受損組織的再生[34]。生長阻滯特異性蛋白-6與肝再生有關，其存在于DPSCs-CM中，但不存在于BMSCs-CM中，故BMSCs-CM中未觀察到以上反應。由此可見，DPSCs-CM旁分泌機制對實體器官纖維化具有重要的治療作用，DPSCs-CM可能成為治療肝臟或臟肺等實質器官衰竭的有效工具。

2.6DPSCs-CM與糖尿病 糖尿病是機體胰島素作用或分泌受損而引起的慢性代謝性疾病。使用分化的干細胞或胰島β細胞移植來補充丟失的產胰島素細胞，可能是替代傳統胰島素治療糖尿病的新方法[35]。此外，糖尿病常導致嚴重的并發癥，如周圍神經病變、血管病變。手術治療是目前糖尿病并發癥的主要治療方法。

DPSCs不僅具有向胰島樣聚集物分化的能力，還可以葡萄糖依賴的方式釋放胰島素[36-37]。DPSCs-CM可通過對胰島β細胞的保護和增殖作用促進胰島素分泌，并減少細胞死亡，改善體外糖尿病模型的高血糖狀態，可見，DPSCs-CM對胰島β細胞的生存和功能都有影響[38]。Kanafi等[39]的研究證實，DPSCs-CM可使小鼠血糖達到正常水平。大量研究證明，DPSCs可通過旁分泌作用分泌神經生長因子、血管內皮生長因子，有助于減少糖尿病導致的周圍神經病變和血管病變[19,31-32]。

DPSCs-CM治療較DPSCs移植治療的不良反應少，且不需要使用免疫抑制劑，可見DPSCs-CM是一種更安全、侵入性更小的治療糖尿病的方法，其治療效果較BMSCs-CM更明顯。但是，DPSCs-CM治療糖尿病的具體臨床作用機制和有效性仍有待進一步的研究。

3 小 結

DPSCs較其他組織來源的MSCs具有巨大的優勢。口腔組織分離的MSCs來源于胚胎，是神經嵴源性細胞[40-41]。DPSCs可分化為中胚層，也可分化為非中胚層組織細胞(神經源細胞、肌源細胞、角化細胞、肝細胞、黑素細胞)，并表現出神經功能[3]。MSCs-CM進一步發揮了MSCs的再生誘導能力，DPSCs-CM也受到了廣泛關注。DPSCs-CM在口腔醫學領域的組織修復和再生具有巨大的應用潛力，其優越性將成為無細胞治療和再生醫學的新標準，并成為修復組織缺損與再生的新手段，期待DPSCs-CM的進一步臨床研究和應用為再生醫學做出貢獻。