細胞因子與新生兒壞死性小腸結腸炎的相關性

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(浙江省慈溪市人民醫院新生兒科，浙江 慈溪 315300)

壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是早產兒常見病，主要臨床癥狀有腹脹、腸梗塞、便血等[1]。NEC病因尚不明確，目前認為異常細菌感染、腸道內缺血/氧、不當食用配方奶以及早產是NEC的高危因素。也有研究表明cdx1、cdx2、Lgr5、PTEN等基因的異常表達會增加NEC風險[2-6]。早產兒腸道發育不成熟，微血管物理性的張力失衡等原因也會導致腸道菌群脫離其原生環境，引起腸道內菌群種類與數量失衡，而胃腸道致病菌感染引起的炎癥介質釋放導致腸道損傷是導致NEC發生發展的重要因素，NEC的發生與炎癥介質腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor， TNF)、血小板活化因子(platelet activating factor， PAF)、白細胞介素-4(interleukin 4， IL-4)、白細胞介素-6(interleukin 6， IL-6)密切相關[7-8]。NEC一般從小腸粘膜開始發病，然后累及腸壁全層甚至導致穿孔，如不及時控制，有引發敗血癥和其他嚴重威脅生命的疾病[9]，因此，及早診斷、準確判斷NEC病情并采取正確治療有重要意義。為進一步評估NEC與炎癥因子的相關性，本文對124例NEC患兒血清中IL-6、TNF-α、IL-4濃度進行了測試，發現疾病活動程度不同的患兒血清中IL-6、TNF-α、IL-4濃度具有顯著差異，具體研究報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年7月至2018年5月浙江省慈溪市人民醫院收治的NEC患兒124例為研究對象，其中男性患兒64例，女性患兒60例，平均胎齡為(34.7±0.5)周，順產71例，剖宮產53例，體重(1 697.82±52.37)g 。

根據NEC的BELL劃分標準，觀察組包括Ⅰ期68例(均為ⅠB期)，Ⅱ期40例(ⅡA期29例，ⅡB期11例)，Ⅲ期16例(均為ⅢA期)。為了直觀的比較細胞因子水平與NEC的關系，另外選取同時期本院出生的100例足月、健康新生兒為對照組，兩組年齡、性別、母親年齡組間比較差異均無統計學意義(均P>0.05)，而NEC組胎齡、體重、順產比例均低于對照組(均P<0.05)，見表1。

項目NEC組(n=124)對照組(n=100)χ2/tP胎齡(周)34.71±0.5338.85±1.164.910.01年齡(天)13.85±4.4815.64±5.821.830.38性別0.010.94 男75(60.48)61(61.00) 女49(39.52)39(39.00)體重(g)1 697.82±52.373 372.93±983.059.95<0.01生產方式 順產27(21.77)73(73.00)58.78<0.01 剖宮產97(78.23)27(27.00)母親年齡(歲)28.95±5.5826.06±4.722.960.49

1.2方法

1.2.1 NEC患兒分期

參照Bell等人設計的NEC臨床分期標準，具體情況見表2。

1.2.2 IL-6、TNF-α、IL-4濃度的測試

兩組新生兒均取頭皮靜脈血1mL，常規EDTA抗凝，3 000r/min離心10min，4℃冰箱保存至檢測。本研究中IL-4、IL-6和TNF-α檢測采用酶聯免疫吸附(ELISA)，試劑盒均購自Sigma，操作步驟嚴格按照說明書進行，樣品的提取及保存也嚴格按照說明書要求進行。

表2 Bell關于NEC的臨床分期標準及其對應的癥狀

Table 2 Bell’s clinical staging criteria for NEC and their corresponding symptoms

NEC臨床分期對應的癥狀Ⅰ期可疑NEC階段 ⅠA期體溫或高或低、呼吸暫停、心跳低于正常值、嗜睡,有輕微腹脹,偶有嘔吐,MRI可檢測到輕微腸梗塞 ⅠB期臨床NEC階段在IA期的基礎上有便血的情況出現Ⅱ期確診NEC ⅡA期在ⅠB期的基礎上腸鳴音消失,部分患兒有腹部壓痛感,MRI可見明顯的腸道擴張、梗塞 ⅡB期在ⅡA期的基礎上出現門靜脈積氣,幾乎所有患兒有腹部壓痛感,可見腹部積水Ⅲ期進展期NEC ⅢA期在ⅡB期的基礎上出現腹膜炎,腹部積水更加明顯 ⅢB期同ⅢA期,但是各項內容更加顯著

1.2.3糞便DNA的提取

兩組新生兒均取新鮮糞便，排便需用統一、無菌容器進行收集，然后使用無菌藥勺取糞便中間樣本1g，置于1.5mL的無菌的一次性無菌糞便采集管中，要求每一例患兒取樣4管，以防止實驗失敗需要重復。將本置于干冰盒內冷鏈運送至微基生物科技(上海)有限公司，進行糞便DNA提取與分析。 以16S rRNA 的 V3～V4 區域作為目標DNA序列，進行 PCR擴增。以 通 用 引 物 338F ( 5′-ACTCC￣TACGGGAGGCAGCA-3′) 和 506R ( 5′-GGAC￣TACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對 16s rDNA 的 V3～V4 進行擴增。 PCR反應條件為 95℃預變性 3min，95℃ 變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45s，25個循環；72℃延伸20min。擴增結束后，PCR擴增產物使用 2% 瓊脂糖進行凝膠電泳[10]。檢查擴增效果，合格樣品送Illumina-MiSeq平臺進行高通量測序，菌落豐富度以Shannon指數和Simpson 指數表示。

1.3統計學方法

本研究中的所有數據全部采用統計學軟件SPSS 19.0進行分析，計量資料均采用均數±標準差表示，其計數資料采用比例(%)表示，計量資料組間差異采用t檢驗，組內差異采用方差分析，計數資料采用χ2檢驗；采用Pearson相關分析比較Shannon和Simpson菌群豐富度指數與細胞因子濃度的相關性，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1兩組新生兒IL-6、TNF-α、IL-4濃度比較

NEC組的IL-6、TNF-α和IL-4濃度均高于對照組，組間比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表3。

Table 3 Comparison of serum IL-6, TNF-α and IL-4 concentrations between two

2.2 NEC患兒細胞因子濃度與NEC臨床分期的關系

NEC組各期IL-6、TNF-α、IL-4濃度逐漸升高，組內比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，其中Ⅱ期高于Ⅰ期(t值分別為5.96、7.81、6.00，均P<0.05)，Ⅲ期高于Ⅱ期(t值分別為6.95、5.01、5.01，均P<0.05)，見表4。

Table 4 The relationship between cytokine concentrations and NEC clinical

2.3 NEC患兒促炎細胞因子TNF-α和IL-6濃度與腸道菌群豐富度相關性

TNF-a和IL-6濃度與Shannon指數呈負相關性(P<0.05)，與Simpson 指數呈正相關(P<0.05)，見表5。

表5 NEC患兒促炎細胞因子TNF-α和IL-6濃度與腸道菌群豐富度相關性

Table 5 Relationship between proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 concentration and richness of intestinal flora

研究內容Shannon指數Simpson 指數PTNF-α濃度r=-0.56r=0.47均<0.05IL-6 濃度r=-0.35r=0.81均<0.05

3討論

3.1 NEC的研究現狀及其與抗炎或促炎細胞因子的關系

NEC是一種獲得性疾病，其高發部位為回場末端，典型特征是腸道粘膜甚至腸深層的壞死。NEC的發病原因多樣，其中細菌感染是導致NEC發生的最主要原因之一。人體腸道中大約存在500～1 000多種細菌，這些細菌數量巨大，會通過代謝或繁殖對身體狀況造成重大影響。最為常見的腸道細菌是革蘭氏陰性桿菌，它們可產生內毒素脂多糖對腸道起到直接作用，引發腸道炎癥反應，使免疫因子如白細胞介素以及細胞壞死因子的異常表達，損傷腸道內壁。與此同時，內毒素多糖脂可以增加患兒體內信號肽分子的活性，增高腸道細胞的黏附性，從而抑制腸道上皮細胞修復的過程[11]。

引起新生兒NEC的另外一個原因是腸壁缺氧、缺血和再灌注損傷等，新生兒在出生時若出現缺氧、窒息等會導致腸系膜的血流量減少，并且有可能導致小腸缺血部位壞死，嚴重損傷腸黏膜屏障。腸系膜是人體最主要的三大免疫器官之一，上面有豐富的淋巴結，對腸道菌群的穩定、平衡起到重要作用，所以腸系膜的損傷至少從兩個方面導致了NEC發生[12]。此外早產和喂養不當也是引發NEC的重要原因[13-14]。有研究證明TNF-α、PAF、促炎和抗炎細胞因子等多種細胞因子與信號通路參與到NEC的發生[15]。對于NEC的治療，目前臨床上主要有保守治療和手術治療兩種方式，但是對于Ⅲ期NEC患兒，其治愈效果較差，因此，NEC的預防和及早診斷具有重要意義。在本研究中，我們比較了NEC患兒與正常新生兒IL-6、TNF-α、IL-4的濃度差異，發現NEC組各因子濃度高于健康新生兒，而且隨著NEC嚴重程度的增加，IL-6、TNF-α、IL-4的濃度也有上升趨勢，說明這些細胞因子對于反映NEC病情也有一定的參考價值，可以作為輔助指標。

3.2分子微生物技術研究腸道微生物概況

通過微生物的分離培養及生化性狀和特定表型的鑒定，可以有效的評價微生物的抗生素敏感性和致病性。但是一般情況下環境中的微生物含量較少，對絕大多數微生物的群落功能及系統發育關系無法進行深度研究。隨著分子生物學技術的引入，我們可以對環境中的優勢菌群進行辨識，但是檢測分辨率、精度仍不盡如人意，且費時費力。隨著第二代高通量測序技術的普及，讓我們全面認識腸道微生物群落結構、組成變化及其與宿主的相互作用關系成為了可能[16]。憑借高通量測序，我們可以準確測定NEC患兒糞便中的異常菌群，從而選取合適的抗生素進行治療。Shannon指數(即香農威納指數)是估算樣本中微生物多樣性的重要指標，其值越大，說明菌群多樣性就越高。Simpson 指數則描述從一個群落種連續兩次抽樣所得到的個體屬于同一種屬的概率，故該值越大，物種(菌群)多樣性越低。在本研究中測量了124例NEC患兒的Shannon指數法和Simpson 指數，發現TNF-a和IL-6濃度越高，Shannon指數越小，二者之間具有密切的負相關性，與此相對應，TNF-a和IL-6濃度越高，Simpson 指數越大。說明NEC會導致患兒腸道中菌群豐度的下降，且這種原因與促炎和抗炎細胞因子IL-6、TNF-α、IL-4的濃度有密切聯系。

綜上所述，抗炎或促炎細胞因子濃度與NEC的臨床分期及腸道菌群豐富度密切相關，可作為NEC病情診斷的輔助指標。

[專業責任編輯:史曉薇]