蜂毒肽對膠原誘導關節(jié)炎大鼠模型Th17/Treg平衡及炎癥的影響

譚 寧，賀守第,關 麗，楊平常，劉志剛，黎德育*

(1. 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院， 廣州 510000;2.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)風濕科，廣東 深圳 518060；3. 深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院風濕免疫科 廣東 深圳 518000;4. 深圳大學過敏反應與免疫學研究所 廣東 深圳 518055)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種引起多關節(jié)功能障礙及畸形的自身免疫性疾病[1]。雖然RA的發(fā)病機制并不完全明確，但目前發(fā)現(xiàn)遺傳和免疫因素與類風濕關節(jié)炎相關。RA的病因是多方面的，但主要炎癥因子及促炎細胞因子的過度表達是本病大多數(shù)病理過程中的重要原因。雖然現(xiàn)在公認類風濕關節(jié)炎是以Th1細胞介導的炎癥性疾病，但研究發(fā)現(xiàn)除了Th1細胞，Th17細胞在促進類風濕關節(jié)炎的炎癥和疾病進展起重要作用。Th17細胞產(chǎn)生IL-17誘導關節(jié)炎癥，同時還能激活核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)促進骨質(zhì)破壞[2-3]。而Th17細胞的活化需要TGF-β、IL-10和IL-23等炎癥因子的激活。研究表明調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)分泌諸如IL-10等免疫抑制性細胞因子，并抑制RA進程中的免疫反應。最近有人認為Th17和Treg細胞之間的相互平衡可能是的重要治療策略[4-5]。

目前治療RA的西藥有非類固醇抗炎藥物、改變病情抗風濕藥物、糖皮質(zhì)激素以及生物制劑等。雖然上述藥物對RA有較好的治療作用，但是副作用大、價格昂貴，致使病人的依從性差，臨床應用受到很大的限制。中醫(yī)藥對于風濕病的治療有著悠久的歷史，蜂毒療法作為中醫(yī)藥的傳統(tǒng)的治療對RA確實有明顯的療效。蜂毒肽(melittin，MT)是蜂毒的主要成分，是蜂毒中具有藥理作用和生物活性的主要組分[6]。MT具有抗炎、降壓、抗風濕性關節(jié)炎及抗腫瘤等多種藥理活性。本實驗通過研究蜂毒肽對膠原誘導關節(jié)炎(collagen induce athritis, CIA)模型關節(jié)炎癥及對Th17/Treg細胞影響，為蜂毒治療類風濕關節(jié)炎提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級健康SD雌性大鼠30只，體重150～170 g，購于廣東省實驗動物中心[SCXK(粵)2014-0035 ]；飼養(yǎng)于深圳大學醫(yī)學部SPF實驗動物中心 [SYXK(粵)2014-0140]。飼養(yǎng)條件：自由取水和進食，溫度20℃～25℃，相對濕度40%～50%，照明時間為白天12 h和黑夜12 h，適應性飼養(yǎng)1周。實驗動物飼養(yǎng)及實驗處理均嚴格遵循深圳大學實驗動物福利與倫理委員會相關指南要求(倫理審查號：2014-167)。

1.2 主要試劑與儀器

蜂毒肽(分子式：Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Thr-Gly-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2，濃度98%，北京中科亞光生物科技有限公司合成)；牛II型膠原(批號：C7806，美國Sigma公司)；完全弗氏佐劑(批號：F5881，美國sigma公司)；不完全弗氏佐劑(批號：F5506，美國sigma公司)； Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD25 APC、Anti-Mouse/Rat IL-17 A PE、Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE、Foxp3/Transcription Factor Staining B、Cell Stimulation Cocktail、Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer、Flow Cytometry Staining Buffer (批號分別為：11-0040-82、85-17-0390-82、12-7177-81、85-12-5773-82、00-5523-00、00-4970-03、88-8824-00、00-4222-26,美國Ebiosience公司)；抗大鼠TNF-α血清ELISA試劑盒(批號: 4AA171420，北京四正柏公司)；抗大鼠IL-17 A、IL-10血清ELISA試劑盒(批號：BMS635、BMS629，美國Ebioscience公司)，MTS試劑(G1112,美國Promega公司)。流式細胞儀RACS CAlibur(美國BD Biosciences公司)；全波長酶標儀Multiskar(美國Thermo公司)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱INC108(德國Memmert公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立

將II型牛膠原溶于0.01 mmol/L醋酸，配置成4 mg/mL牛II型膠原溶液；再將配置好的牛II型膠原與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻成油包水乳劑用于造模。同時另外將配置好的牛II型膠原與等體積的不完全弗氏佐劑充分混勻成油包水乳劑用于激發(fā)。將30只雌性大鼠分為空白對照組(6只)、模型組(24只)，第1天在模型組大鼠尾根部1 cm皮下注射牛II膠原與弗氏佐劑乳劑每只150 μL(含牛II型膠原每只0.3 mg)，第10天再次注射配置好的II膠原與不完全弗氏佐劑乳劑每只50 μL(含牛II型膠原每只0.1 mg)，建立膠原誘導關節(jié)炎模型(collagen-induced arthritis，CIA)。正常對照組6只大鼠用同樣方法注入等量滅菌注射用水。

1.3.2 藥物治療

第14天統(tǒng)計關節(jié)腫脹評分，取關節(jié)腫脹評分大于4分的大鼠共18只，同評分的動物按隨機分配原則分為模型組、蜂毒肽組，甲氨蝶呤組，每組各6只。蜂毒肽組(0.5 mg/kg， 溶于滅菌注射用水，腹腔注射，隔日1次)，甲氨蝶呤組(每只1 mg，溶于滅菌注射用水，腹腔注射，每周1次，共3次)，模型組注射等量滅菌注射用水，第32天麻醉處理，心臟穿刺取血，脫頸處死。

1.3.3 標本采集及處理

心臟穿刺取血5 mL，4℃靜置30 min，3500 r/min離心10 min，取血清，放置-80℃冰箱保存，待測；超凈工作臺中分離出大鼠脾臟，剪少量脾臟組織，放入尼龍網(wǎng)中，加入適量淋巴細胞分離液，充分碾磨脾組織至無塊狀物，尼龍網(wǎng)過濾，加入1640培養(yǎng)基，放入離心機(20℃，800 r/min)離心30 min，吸取淋巴細胞層，培養(yǎng)基洗滌。

1.3.4 大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-17 A檢測

采用ELISA法檢測各組大鼠血清血TNF-α、IL-10、IL-17 A的水平，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。采用全波長酶標儀(波長為450 nm)檢測吸光度值(A450值)，繪制標準化曲線，計算TNF-α、IL-10、IL-17 A含量。

1.3.5 脾臟淋巴細胞活性檢測

取分離好的脾臟淋巴細胞，以200 μL細胞懸液(細胞數(shù)約2×105個)加入96孔板中；細胞培養(yǎng)箱孵育過夜后，加入20 μg/mL的collagen 100 μL，培養(yǎng)3 d后，加入20 μL的MTS試劑，培養(yǎng)4 h后，采用全波長酶標儀(波長為450 nm)檢測吸光度值(A450值)。

1.3.6 Th17、Treg細胞檢測

(1)Th17細胞檢測:取分離好的脾臟淋巴細胞，稀釋至1×108/mL，加入培養(yǎng)板中，加入2 μL cell stimulation cocktail，孵育16 h。1400 r/min離心5 min，加入2 mL培養(yǎng)基，取100 μL加入流式上樣管，加入anti-rat-CD4-APC，4℃孵育30 min。離心5 min，去上清，加入1 mL IC Fixation Buffer，室溫孵育20 min，離心5 min，去上清，洗滌兩次。再次加入1 mL IC Fixation Buffer，避光4℃孵育20 min，加入2 mL Permeabilization Buffer后，離心10 min，棄上清；100 μL破膜緩沖液重懸細胞，室溫孵育15 min，離心5 min，加入anti-rat-IL-17 A-PE。4℃避光孵育30 min； 1mL Permeabilization Buffer混勻后，離心5 min，去上清，加入1 mL流式細胞緩沖液重懸細胞。并上機檢測并分析，應用Flowjo7.61分析數(shù)據(jù)。

(2)Treg細胞檢測:取分離好的脾臟淋巴細胞，稀釋至1×108/mL，取100 μL加入流式上樣管，依次加入anti-rat-CD4-FITC和anti-rat-CD25-APC(說明書劑量)， 避光4℃孵育30 min。Flow Cytometry Staining Buffer 1 mL洗滌后，1400 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL的Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer，混勻避光4℃孵育30 min，F(xiàn)low Cytometry Staining Buffer 1 mL洗滌；加入1 mL的固定/破膜工作液，避光4℃孵育20 min。加入2 mL Permeabilization Buffer后，離心10 min，棄上清。重懸細胞，加入anti-rat-Foxp3-PE，避光4℃孵育40 min。加入2 mL Permeabilization Buffer，離心10 min，棄上清，流式緩沖液重懸細胞，并上機檢測并分析，應用Flowjo7.6.1分析流式數(shù)據(jù)。

1.3.7 踝關節(jié)HE染色

取大鼠雙踝關節(jié)，剔除皮膚和脂肪，固定24 h，放入10% EDTA-2Na脫鈣，隔日1次換液，60 d后分離踝關節(jié)；分別脫水，包埋，HE染色，光鏡下觀察踝關節(jié)病理組織變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-17 A濃度

通過ELISA檢測血清中特異性TNF-α、IL-10、IL-17的濃度，與正常組比較，模型組中TNF-α、IL-10、IL-17 A水平高于正常組(P<0.01，P<0.05，P<0.05)；與模型組比較，蜂毒肽組、甲氨蝶呤組TNF-α、IL-17 A低于模型組(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，蜂毒肽組、甲氨蝶呤組IL-10高于模型組(P<0.05)。(表1)

2.2 脾臟淋巴細胞活性檢測

通過MTS法檢測脾臟淋巴細胞活性，與正常組比較，模型組單個核細胞活性高于正常組(P<0.01)；與模型組比較，蜂毒肽組、甲氨蝶呤組單個核細胞活性低于模型組(P<0.05)。(圖1)

2.3 大鼠脾細胞Th17、Treg細胞比較

通過流式細胞術檢測脾細胞Th17、Treg細胞比例，與正常組比較，模型組Th17細胞比例高于正常組(P<0.01)；與模型組比較，蜂毒肽組、甲氨蝶呤組Th17細胞比例低于模型組(P<0.05)；與模型組比較，蜂毒肽組、甲氨蝶呤組Treg細胞比例高于模型組(P<0.01，P<0.05)(圖2)。

2.4 大鼠踝關節(jié)HE染色

通過HE染色，顯微鏡下觀察踝關節(jié)病理變化：正常組：可見關節(jié)結(jié)構(gòu)完整，單層滑膜組織，無炎性細胞浸潤，無滑膜增生和血管翳形成，無骨和軟骨破壞；模型組：可見關節(jié)結(jié)構(gòu)不完整，大量滑膜組織增生，大量炎性細胞浸潤，明顯的骨和關節(jié)軟骨破壞。蜂毒肽組：可見關節(jié)結(jié)構(gòu)不完整，部分的滑膜組織增生及炎癥細胞浸潤，部分骨和關節(jié)軟骨破壞。甲氨蝶呤組：可見關節(jié)結(jié)構(gòu)完整，部分滑膜組織增生，少量炎性細胞浸潤，無明顯的血管翳、骨和關節(jié)軟骨破壞。(圖3)

表1 大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-17 A濃度水平的比較Table 1 Comparison of the serum levels of TNF-α, IL-10, and IL-17 A in rat serum

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the normal group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the model group,#P< 0.05,##P< 0.01.

注： 與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖1 脾臟淋巴細胞活性檢測Note. Compared with the normal group, **P < 0.01. Compared with the model group, #P< 0.05.Figure 1 Detection of the splenic lymphocyte activity

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，##P<0.01。圖2 大鼠脾細胞Th17、Treg細胞檢測Note. Compared with the normal group，**P < 0.01. Compared with the model group，#P< 0.05.Compared with the model group，##P < 0.01.Figure 2 Detection of Th17/Treg cells among rat spleen cells

圖3 大鼠踝關節(jié)病理檢測(HE染色，×4)Figure 3 Pathological changes of the rat qnkle joints(HE staining)

3 討論

RA是一種以周圍關節(jié)炎為特征的自身免疫性疾病。膠原誘導關節(jié)炎模型是最常的類風濕關節(jié)炎研究的動物模型[6]。目前RA的病因和發(fā)病機制尚未完全明確，蜂毒肽是蜂毒的主要成分，蜂毒肽具有抗炎作用，但對其免疫調(diào)節(jié)的作用研究知之甚少。本研究表明蜂毒肽能抑制膠原誘導關節(jié)炎大鼠模型的脾臟淋巴細胞活性，說明蜂毒肽具有抑制免疫作用。

目前Th17/Treg細胞平衡成為自身免疫性疾病的研究熱點。研究表明類風濕關節(jié)炎中如TNF-α、IL-10等炎癥介質(zhì)，激活 T細胞分化，促進Th1、TH17和Treg細胞等T淋巴細胞參與關節(jié)炎癥的發(fā)病機制[7]。Th17細胞分泌的IL-17與其他炎癥因子促進關節(jié)的炎癥，并且抑制Treg細胞分化。而Treg細胞產(chǎn)生IL-10，能夠限制炎癥反應引起的組織損傷[8-9]。IL-10缺乏能夠刺激Th1和Th17細胞分化，抑制Treg細胞分化，導致RA疾病的發(fā)生[10]。因此，Th17/Treg平衡，包括Th17細胞分泌的促炎癥因子和Treg細胞分泌的細胞因子，在類風濕關節(jié)炎疾病等自身免疫性疾病中起著非常重要的作用。既往的研究表明在類風濕關節(jié)炎中Th17細胞明顯增加，而Treg細胞則顯著減少[11]，本研究證實模型組大鼠脾臟淋巴細胞中Treg細胞的的表達下降，Th17細胞的表達水平升高。在本研究中，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽提高了IL-10水平，并在體內(nèi)增加了Treg細胞的分化，這些結(jié)果表明，蜂毒肽通過促進IL-10的表達和促進Treg細胞的分化而減弱CIA的炎癥。同時發(fā)現(xiàn)治療后IL-17 A、TNF-α濃度降低，在CIA模型中Th17細胞比例減少，說明蜂毒肽能通過降低Th17細胞比例，減少CIA模型炎癥。傳統(tǒng)的治療RA的經(jīng)典藥物是甲氨蝶呤等免疫抑制劑。該研究表明甲氨蝶呤也能調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞的失衡。

類風濕關節(jié)炎的病理機制主要是滑膜增生，形成血管炎，導致軟骨破壞及骨侵蝕。本研究通過觀察踝關節(jié)病理切片，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能抑制滑膜增生，本研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能抑制關節(jié)炎模型血清炎癥因子表達，說明蜂毒肽可能通過抑制炎癥因子改善關節(jié)癥狀。同時發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽組踝關節(jié)的軟骨破壞及骨質(zhì)侵蝕減少，而類風濕關節(jié)炎中，骨質(zhì)破壞與RANKL通路及基質(zhì)金屬蛋白酶表達有關[12]，本課題組推測蜂毒肽可能通過抑制RANKL通路等抑制骨質(zhì)破壞，這也是下一步將繼續(xù)探究的方向。

綜上所述，蜂毒肽抑制膠原誘導關節(jié)模型炎癥因子的表達，抑制關節(jié)滑膜增生及延緩骨質(zhì)破壞，同時能上調(diào)Treg細胞、降低Th17細胞起到抑制免疫作用。因此，本研究提示蜂毒肽可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡來治療RA。