蒙古族2型糖尿病合并大血管病變與脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性

董艷慧 韓立坤

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

糖尿病(DM)大血管并發(fā)癥是導(dǎo)致2型糖尿病(T2DM)患者致殘、致死的主要原因，占所有DM患者死亡原因的59%〔1〕。因此，T2DM大血管并發(fā)癥的一級預(yù)防是DM治療中的一個重要方面〔2〕。有研究顯示脂聯(lián)素基因的錯義突變可導(dǎo)致血漿脂聯(lián)素水平下降，并認(rèn)為這是T2DM的發(fā)病原因〔3，4〕；也有研究顯示脂聯(lián)素基因在大血管紊亂中扮演保護(hù)性角色，但是不同地區(qū)不同種族脂聯(lián)素基因表達(dá)不同〔5〕。既往的研究〔6〕多集中在脂聯(lián)素基因外顯子和內(nèi)含子區(qū)，有關(guān)脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)的基因多態(tài)性與T2DM大血管病變的研究較少。通遼市是蒙古族人口最集中的地區(qū)，T2DM發(fā)病率較高，故本研究旨在通過對脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)SNP-11426(rs16861194)、SNP-11391(rs17300539)、SNP-11377(rs266729)3個位點上的基因型和等位基因頻率的分析，探討其多態(tài)性與蒙古族T2DM大血管病變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2015年12月至2017年12月長期居住于內(nèi)蒙古通遼市，在內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院門診或住院確診的四代以上均為蒙古族的患者430例，其中T2DM不合并大血管病變組(T2DM組)200例，男106例，女94例，平均年齡(45.91±12.18)歲；T2DM合并大血管病變組(T2DM+大血管病變組)230例，男127例，女103例，平均年齡(57.74±8.86)歲。T2DM診斷及分型依據(jù)1999年WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)。大血管病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕：(1)四肢大血管病變：經(jīng)外周超聲檢查證實外周血管動脈粥樣硬化，有缺血性表現(xiàn)或閉塞、間歇性跛行、足背動脈消失、休息痛，甚至缺血性潰瘍或壞疽等臨床表現(xiàn)。(2)冠心病：有典型心絞痛或心肌梗死及心電圖表現(xiàn)者，或冠脈造影明確診斷者。(3)腦血管病：病史中出現(xiàn)偏癱或其他腦局灶性癥狀，且顱腦CT掃描或磁共振成像(MRI)顯示有缺血或出血改變者。入選對象均排除遺傳性疾病家族史及嚴(yán)重的全身系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書，同時通過詢問確保樣本間無血緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1一般資料及生化檢測 專人測量身高(cm)、體重(kg)，計算體重指數(shù)(BMI)，BMI=體重(kg)/身高(m)2。記錄飲酒史(是/否)、吸煙史(是/否)、血壓(mmHg)。空腹8 h后，清晨檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)，空腹血糖(FPG)，空腹胰島素(FINs)、空腹C肽、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等指標(biāo)。以上所有生化指標(biāo)檢測試劑盒均由羅氏公司提供。

1.2.2外周血DNA提取 按照人血液基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物有限公司提供)說明書提取外周血DNA。

1.2.3PCR引物設(shè)計與擴(kuò)增 從GenBank中查取人脂聯(lián)素基因序列，采用Oligo7軟件進(jìn)行在線引物設(shè)計，由深圳華大基因股份有限公司合成，引物序列均為前向：5'ATCTCAACGGCCTAATGTGAC3',反向：5'GAAGTGGCAACATACAACACC3'。PCR反應(yīng)體系：10倍Taq PCR緩沖液5.0 μl，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μl，上游引物2.0 μl，下游引物2.0 μl，Taq酶0.5 μl，MgCl22.5 μl，DNA模板2.0 μl，ddH2O 31.0 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 8 min;變性95℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，末端延伸72℃ 10 min，4℃保存，共進(jìn)行35個循環(huán)，目的片段長約355 bp。

1.2.4測序與基因型的確定 擴(kuò)增后有效的PCR產(chǎn)物，送北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司進(jìn)行測序。

1.3統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計量資料組間比較采用t檢驗，等位基因頻率、基因型頻率采用直接基因計數(shù)法計算。計數(shù)資料單因素分析采用χ2檢驗。以Hardy-Weinberg平衡檢驗確定研究樣本的群體代表性。

2 結(jié) 果

2.1一般資料及生化指標(biāo)比較 兩組性別分布、飲酒史、吸煙史、BMI、TC、LDL-C差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而T2DM+大血管病變組年齡、SBP、DBP、FPG、HbA1c、FINs、C肽、TG、HDL-C均高于T2DM組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組入選者一般資料及生化指標(biāo)的比較

與T2DM組比較：1)P<0.05

2.2DNA提取與PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取的DNA及擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物均行1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用GDS7500凝膠成像系統(tǒng)(UVP，德國)照相記錄，觀察分析結(jié)果，確保DNA及PCR產(chǎn)物質(zhì)量。電泳圖顯示清楚，干凈無其他雜帶，見圖1、2。

圖1 人血液中提取的基因組DNA瓊脂糖電泳檢測其純度

圖2 基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測其純度

2.3PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的BLAST分析證實為目的脂聯(lián)素基因，與本研究SNP位點吻合，部分測序結(jié)果見圖3～5。

圖3 SNP-11377位點測序圖

圖4 SNP-11426位點測序

圖5 SNP-11391位點測序

2.4兩組脂聯(lián)素基因型頻率及等位基因頻率比較 T2DM+大血管病變組SNP-11426位點AA、AG、GG；SNP-11391位點GG、GA、AA；SNP-11377位點CC、CG、GG基因型頻率及等位基因頻率與T2DM組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 脂聯(lián)素基因各位點基因型頻率及等位基因頻率比較〔n(%)〕

3 討 論

脂聯(lián)素基因已經(jīng)被證明是T2DM的易感基因〔8〕，其啟動子區(qū)域SNP位點通過調(diào)控脂聯(lián)素基因的轉(zhuǎn)錄影響脂聯(lián)素表達(dá)水平〔9〕，從而增加胰島素敏感性及具有抗炎等作用，能夠改善糖代謝和胰島素抵抗。有研究表明脂聯(lián)素基因還參與了T2DM大血管疾病的發(fā)生，在阻止T2DM大血管病變中扮演保護(hù)性角色〔10〕，但脂聯(lián)素基因與T2DM及并發(fā)癥的相關(guān)性存在種族、地域、環(huán)境、遺傳背景的差異。國內(nèi)研究其與T2DM并發(fā)癥的關(guān)系多集中在脂聯(lián)素基因外顯子及內(nèi)含子區(qū)域的SNP，如有研究表明脂聯(lián)素基因內(nèi)含子區(qū)SNP+276(G>T)與T2DM大血管病變無關(guān)〔11〕。同時也有研究表明脂聯(lián)素基因外顯子區(qū)SNP+45(T>G)不是T2DM合并冠心病的關(guān)聯(lián)因素〔12〕。關(guān)于脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)與T2DM及其并發(fā)癥關(guān)系的研究較少，多是單個橫斷面研究，如有研究提示脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)SNP-11377(C>G)與T2DM患者肱踝脈搏波傳導(dǎo)速度正相關(guān)，進(jìn)一步推斷其可能是T2DM大血管病變的易感基因〔13〕。還有研究表明脂聯(lián)素基因啟動區(qū)SNP-11377(C>G)與T2DM患者頸動脈中層厚度有關(guān)〔14〕。國外有一項研究沙特阿拉伯人脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)SNP-11426(A>G)、SNP-11391(G>A)、SNP-11377(C>G)與T2DM合并冠心病無關(guān)〔15〕，而另一項加勒比非洲血統(tǒng)人類脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)SNP-11391(G>A)與T2DM大血管病變的研究結(jié)果也表明二者無關(guān)〔16〕。以上結(jié)果不盡相同，進(jìn)一步證明脂聯(lián)素基因多態(tài)性存在種族地域異質(zhì)性。現(xiàn)國內(nèi)尚缺乏有關(guān)蒙古族脂聯(lián)素基因與T2DM大血管病變風(fēng)險關(guān)系的研究。本研究結(jié)果顯示其多態(tài)性與本地區(qū)蒙古族T2DM大血管病變無相關(guān)性，不是其患病的危險因素，可能與其他風(fēng)險因素存在交叉作用。本研究結(jié)果也提示，隨著年齡的增加，為防止T2DM大血管病變的發(fā)生，臨床上應(yīng)重視控制血糖、血壓、三酰甘油等水平，積極治療。本研究吸煙史與飲酒史兩組間無差別，與T2DM大血管病變危險因素分析〔17〕結(jié)果不一致，可能與選擇病例存在偏移有關(guān)。本研究觀察的樣本量尚少，有一定的局限性，有待進(jìn)一步加大樣本進(jìn)行更加深入的研究。