高危型人乳頭瘤狀病毒感染和p16INK4A在食管鱗癌患者中的預后價值

王寧寧 王展梅 曹芳麗 曲琳莉 孟思博 玄甜甜 孫穎

(1山東大學齊魯醫院(青島)化療科，山東 青島 266035；2聊城市人民醫院腫瘤科)

在發展中國家，食管癌是非常常見的消化道惡性腫瘤，預后不佳〔1〕。我國北方地區是食管癌發病率最高的地域之一〔2〕，據2015年最新統計，食管癌發病率位居第3，僅次支氣管肺癌、胃癌〔3〕，死亡率次于支氣管肺癌、胃癌、肝癌，居腫瘤相關死亡的第四位，5年生存率僅10%左右〔4〕。世界上每年超過55萬的新發惡性腫瘤患者與HPV感染有關〔5〕。根據以前的研究報道，人乳頭瘤病毒(HPV)16是最常見的感染類型，其次常見的是HPV18〔6〕，其他亞型的HPV感染極為罕見〔7〕。1981年Syrj?nen提出了食管癌發生的誘因之一為HPV感染〔8〕，之后越來越多的研究發現HPV感染是食管癌發生發展的一個危險因素，但HPV感染在腫瘤的發生發展中的致癌機制不清楚，具有爭議。回顧性的臨床研究中，HPV陽性的患者比陰性的患者具有較好的預后〔9～13〕。基于以前的研究，我們試圖確定食管癌中HPV感染和p16的表達，我們也試圖評估p16和HPV感染在進行根治術的食管鱗癌患者中的預后價值。我們希望找到一個更合理的治療方式，我們最大的目標是希望可以利用現有的和正在開發的HPV疫苗，通過大規模疫苗接種預防和治療這些HPV相關的惡性腫瘤。

1 材料與方法

1.1病人和組織標本 我們查詢山東大學齊魯醫院的病案室有關食管癌患者的資料，選擇2006年12月至2008年1月行食管癌手術的273例患者為研究對象，排除術前進行放化療的患者及術后30 d內死亡的患者，其他的排除標準包括：非鱗狀細胞的病理類型、不能合作及失訪的患者，所有患者要求18歲以上，山東大學齊魯醫院倫理委員會備案。具有足夠的蠟塊進行切片行各項檢測的共有105例患者符合入組標準，所有患者簽寫書面的知情同意書。105例患者有足夠的蠟塊進行切片行各項檢測，每1例患者經HE染色確診為食管鱗癌，術后臨床分期以2010版AJCC分期為標準〔14〕。2011年全新修訂的中國居民膳食指南中指出，飲酒史以0.025 kg/d為分界線。血紅蛋白分界點為男性120 g/L和女性110 g/L。105例患者中男81例，女24例，中位年齡60(42～78)歲，中位隨訪時間42.4(4～61)個月。39例患者檢測p16陽性。

1.2手術 食管癌根治術的類型包括Ivor-Lewis和三切口(右開胸，開腹和左頸部切口)。大多數患者接受了Ivor-Lewis手術(n=92)。

1.3隨訪 所有患者隨訪至死亡或滿5年。隨訪時間為從手術日期至死亡或最后一次接觸之日。術后2年內每3個月復查，以后每6個月復查病情，項目包括體格檢查、血液及影像檢查，必要時進行食管鏡檢查。常規的臨床參數是從住院患者數據庫或山東大學齊魯醫院門診腫瘤登記處獲得。

1.4實驗室檢查 石蠟切片常規處理后用生物素標記的高危型HPV16或者HPV18標記的DNA探針進行檢測，信號放大后二氨基聯苯胺(DAB)系統顯色，蘇木精復染。以HPV陽性的子宮頸鱗癌為陽性對照，其棕染的顆粒位于細胞核內，不采用HPV標記探針的結果為陰性對照。食管鱗狀細胞癌胞核內染色為棕色定義為HPV感染陽性〔15〕。所有的結果判定在不知p16結果的情況下進行。免疫組化檢測p16：應用Envision-System法，抗體為鼠抗人p16INK4a單克隆抗體一抗(克隆號：GK500715,Dako，1∶100)，進行信號放大后DAB系統染色，蘇木精復染。陽性對照采用p16陽性表達的切片，陰性對照通過不加一抗獲得。HPV感染陽性的食管鱗癌細胞核呈棕色染色。≥70%的細胞質或(和)細胞核棕染判定為p16陽性。結果由不了解本研究的病理科醫師判定。

1.5研究終點 研究的主要終點是總生存期，定義：從手術日期至死亡或隨訪的最后日期的時間。次要終點包括無進展生存期，定義為從手術日期至局部或遠處復發的時間。局部復發是指區域淋巴結轉移，或腫瘤局部復發。無腫瘤復發的死亡或者原因不明的死亡認定為局部疾病進展相關的死亡。

1.6統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行Mann-Whitney檢驗、χ2檢驗、Kruskal-Wallis檢驗。生存曲線采用Kaplan-Meier法制作，生存率差異分析采用Log-rank檢驗。HPV陽性/陰性的風險比分析采用Cox比例風險模型。

2 結 果

2.1p16與食管鱗狀細胞癌患者臨床及病理因素的相關性 p16陽性的患者表現為較高的分化程度，更好的體能狀態，并且吸煙較少(P<0.05)，見表1。

表1 食管鱗癌105例患者p16陽性表達(n)

1)Kruskal-Wallis

2.2p16蛋白表達與HPV感染的分析 免疫組化染色顯示p16蛋白在食管鱗癌組織的細胞質和(或)細胞核內呈棕染表達；39例患者中86.2%的患者(29例)HPV陽性，原位雜交染色顯示食管鱗癌組織感染的HPV也在細胞核內表達，同樣呈棕染，見圖1。66例p16陰性的患者中僅4例患者(6.1%)檢測到HPV陽性，Kappa檢驗后，Cohen Kappa系數為0.61，p16與HPV兩者的表達具有一致性(P<0.001，Kappa = 0.61;95%CI=0.45～0.77)。

圖1 食管鱗狀細胞癌中p16、HPV陽性表達(×200)

2.3生存分析 根據Kaplan-Meier檢驗結果，p16陽性組患者較HPV陰性組預后較好，p16陽性患者的5年生存率為64.1%，HPV陰性患者5年生存率為45.5%(HR=0.49，95%CI=0.26～0.91，P=0.02)。HPV陰性組患者5年無進展生存率為37.9%，p16陽性組患者5年無進展生存率為58.7%(HR=0.45，95%CI=0.24～0.83,P=0.007)。應用HPV作為分層因素進行預后分析的結果與上述結果一致。HPV陽性組和陰性組的5年生存率分別是64.1%和45.5%(HR=0.31，95%CI=0.14～0.68;P=0.004)。HPV陽性組和陰性組的5年無進展生存率是58.7%和37.9%(HR=0.33，95%CI=0.16～0.68，P= 0.002)。

單因素分析有意義的預后因素包括血紅蛋白(HR=1.71,95%CI=0.54～6.29,P=0.39)、T分期(HR=1.04,95%CI=0.58～2.12,P=0.69)、N分期(HR=1.79,95%CI=0.85～3.78,P=0.13)、吸煙(HR=0.81,95%CI=0.46～1.51,P=0.43)、ECOG體能狀態(HR=3.08,95%CI=1.08～9.04,P=0.04)和p16蛋白表達(HR=4.23,95%CI=1.75～8.54,P=0.03)，經總生存率和無疾病進展率的Cox回歸分析，對總生存率有影響意義的因素是p16蛋白表達和ECOG體能狀態；經血紅蛋白、T分期、N分期、吸煙、ECOG體能狀態等因素校正后，p16蛋白表達是影響患者無疾病進展率的唯一多變量因素(HR=2.52,95%CI= 1.12～5.71,P=0.02)。p16陽性患者較陰性患者降低了58%的死亡風險(校正后HR=0.42,95%CI=0.26～0.91,P=0.03)，降低了61%的疾病進展風險(校正后HR=0.39,95%CI=0.27～0.77,P=0.02)。

3 討 論

HPV是一種小的雙鏈脫氧核糖核酸病毒。本研究結果顯示31.4%的食管鱗癌組織感染HPV，這個結果與既往中國其他食管癌高發區的研究結果是一致的〔16,17〕。本研究的患者來自于山東大學齊魯醫院，山東省在中國屬于食管癌的高發區〔18〕。

HPV感染鱗狀上皮后p16蛋白會出現過度表達已經成為大家公認的結果，在HPV相關的鱗癌組織中p16免疫組化染色早已被認定為一個客觀的HPV感染的生物標志物〔19〕。HPV陰性的腫瘤組織中，9p21的滅活降低了p16蛋白的表達，因此，通過p16蛋白的免疫組化染色來區分腫瘤組織中HPV的陽性或陰性，HPV陰性的食管鱗癌組織中p16蛋白一般呈低表達〔20〕，通常認為p16蛋白水平升高是E7癌蛋白發揮功能的結果，而E7蛋白是HPV感染組織后惡性轉化的關鍵〔21〕。回顧性研究反復報道HPV相關性腫瘤具有較好的預后，這些研究主要是頭頸部腫瘤，尤其是口咽部鱗狀細胞癌〔16～20〕。本研究揭示了p16和HPV感染在食管鱗癌中的預后價值，p16陽性的患者具有較好的預后。應用HPV作為分層因素，預后結果與上述結果大致相同。

本研究通過免疫組化檢測p16和原位雜交法檢測HPV，認為免疫組化p16可作為一種有效的HPV檢測替代辦法。免疫組化技術操作簡單，重復性好，成本低，適合于廣泛地臨床推廣和使用〔12〕。

本研究清楚地表明，p16陽性表達的患者具有較高的腫瘤的分化程度和較好的體能評分，并且p16陽性的患者吸煙的概更低。這3個方面之間顯著差異可能是解釋p16陽性患者較好的原因。另外1個假說也可以解釋這種現象，HPV結合到DNA中，表達癌蛋白：E6和E7，消弱了p53和Rb蛋白的功能，促進了基因重組〔22〕，重組的DNA理論上對放療和化療更加敏感〔23〕，為HPV陽性患者具有較好預后提供了一個假說。本研究樣本小，無法排除混雜由HPV感染和治療模式帶來的混淆結果，所以不能一定得出確切的定論，需要更大的、多層的分析研究來解釋說明這種結果。

HPV感染和吸煙之間的聯系仍在研究中，有研究表明二者之間具有協同作用〔24〕，煙草誘發的相關的致癌基因的變異可能因為HPV感染，進一步重排，加劇DNA突變，基因組的不穩定性造成細胞周期紊亂，這可以解釋為什么P16陽性患者不太可能是吸煙者，需要進一步的研究證實。

本研究表明，在食管癌中p16蛋白表達與分化程度有關，可以作為腫瘤分化程度的一個參考指標。本研究還發現較高的ECOG評分與p16陽性率有關，ECOG評分低的患者p16蛋白陽性率較低。以前的研究也報道過ECOG體能狀態與p16蛋白的關系，但二者之間的關聯目前沒有明確的解釋，可能與這些研究的樣本量小有關〔25〕。

本研究明確表明經根治術后HPV相關性或者p16陽性的食管癌患者具有較好的預后，而且HPV感染或p16蛋白是獨立的預后影響因子。但由于本研究是小樣本回顧性研究，而且隨訪中出現了部分失訪，還需進行較大樣本量的前瞻性研究證實p16蛋白表達與HPV感染兩者之間的一致性及p16蛋白在分子生物學水平上作為預后因素的可行性。