非小細胞肺癌患者癌胚抗原和細胞角蛋白與表皮生長因子基因突變的關系及靶向治療的預測價值

王洪閣

(濱州市中醫醫院檢驗科，山東 濱州 256600)

非小細胞肺癌(NSCLC)約占全部肺癌的85%以上〔1〕，手術和化療是主要治療方案，但80%的NSCLC確診時已處于中晚期，失去手術機會，一線化療患者生存期僅為7～10個月〔2〕。靶向治療是NSCLC治療的趨勢，其中表皮生長因子基因突變的患者對酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物敏感性較好；但由于癌組織獲取困難或標本量過少等原因，導致表皮生長因子基因檢測難以推廣，研究顯示，我國僅9%的NSCLC患者進行了該基因突變檢測〔3〕。而癌胚抗原(CEA)和細胞角蛋白(Cyfra)21-1是最常見的肺癌腫瘤標志物，標本易獲得。本研究旨在探討CEA和Cyfra21-1濃度與表皮生長因子基因突變的關系及對靶向治療效果的預測價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2015年3月至2016年6月NSCLC患者72例，為排除吸煙對CEA的影響，均選擇非吸煙患者，其中男28例，女44例，年齡54～80〔平均(67.15±12.82)〕歲，均為臨床Ⅲ～Ⅳ期，腺癌67例，鱗癌5例。本研究經醫院倫理委員會審批，患者知情同意。

1.2主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒、人表皮生長因子基因突變檢測試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒均購于廣州健侖生物科技有限公司；小鼠抗人p-AKT、磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK1/2)、磷酸化細胞信號傳導與轉錄活化因子(p-STAT)3單克隆抗體和鼠源性β-actin單克隆抗體均購于上海杰美基因醫藥科技有限公司。美國Bio-Rad T100型梯度PCR儀；美國ABI 7500熒光定量PCR儀；羅氏E170自動電化學發光儀。

1.3DNA提取與測序 標本要求：新鮮冰凍組織2～3 g；石蠟包埋標本5～8 μm厚切片3張以上；外周血、胸水標本，需血漿、胸水上清800 μl以上。使用石蠟組織DNA提取試劑盒獲得石蠟包埋標本DNA；新鮮組織DNA提取試劑盒獲得冷凍組織和體液標本DNA。上述標本均經病理確定為NSCLC，按試劑盒說明操作。分光光度法測定提取DNA的濃度，將合格標本冷凍保存待用。巢氏PCR法擴增標本DNA，依次擴增表皮生長因子受體第18～21外顯子。總反應體系30 μl，擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環。瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定擴增結果，之后上測序儀，測序結果與Genbank上序列比對。

1.4環探針擴增阻滯突變系統(ARMS) 使用熒光PCR法對標本行21種人類表皮生長因子受體基因突變檢測。對應不同擴增體系預裝于8聯PCR反應管中：35.5 μl待測DNA(石蠟標本DNA濃度3～4 ng/μl，新鮮組織DNA濃度0.5～0.8 ng/μl)與4.5 μl Taq酶混合后，取其中5 μl分別加入8聯PCR反應管。陽性和陰性對照同時擴增。擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 20 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環，判斷突變結果。

1.5Western印跡檢測表皮生長因子基因下游信號分子 RIPA試劑盒分別提取表皮生長因子基因突變和未突變標本中的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h，分別滴加小鼠抗人p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3一抗(1∶200稀釋)，鼠源性β-actin單抗(1∶500)為內參，4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，孵育4 h，ECL顯色，采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.6外周血CEA、Cyfra21-1檢測和靶向治療評價 治療前抽取患者晨起空腹外周血3 ml，離心分離血清，使用電化學發光儀和配套試劑盒檢測CEA和Cyfra21-1濃度。正常范圍：CEA<5.0 μg/L，Cyfra21-1<3.3 μg/L。根據人類表皮生長因子受體基因突變檢測結果與患者意愿，共32例接受口服吉非替尼，250 mg/d靶向治療。其中男9例，女23例；CEA正常組14例，升高組18例；Cyfra21-1正常組16例，升高組16例；CEA升高和Cyfra21-1正常14例，CEA升高和Cyfra21-1升高或CEA正常和Cyfra21-1正常8例，CEA正常和Cyfra21-1升高10例；表皮生長因子受體突變直接測序陽性24例，ARMS陽性29例。以無進展生存期判斷療效，定義為開始治療到病情進展的時間。

1.7統計學分析 使用SPSS19.0軟件，計量資料行t檢驗；計數資料行χ2檢驗；相關性生存分析使用Kaplan-Meier法，并進行Cox回歸模型多因素分析。

2 結 果

2.1表皮生長因子受體基因突變與腫瘤標志物水平 表皮生長因子受體基因總突變率為62.50%(45/72)。男性基因突變率〔60.71%(17/28)〕與女性〔(63.64%(28/44)〕差異無統計學意義(χ2=1.012,P=0.115)。CEA升高組〔84.21%(32/38)〕明顯高于CEA正常組〔38.24%(13/34)，χ2=11.381,P=0.001〕；Cyfra21-1升高組與正常組〔64.00%(16/25)、61.70%(29/47)〕差異無統計學意義(χ2=0.957,P=0.092)。

2.2表皮生長因子基因下游信號分子表達情況 表皮生長因子基因突變組下游信號分子p-AKT、p-ERK1/2、p-STAT3蛋白相對表達量分別為7.84±0.62、5.03±0.47、9.41±0.82，明顯高于基因未突變組的3.10±0.25、1.94±0.17、4.96±0.47(P<0.05)。見圖1。

圖1 表皮生長因子基因下游信號分子蛋白Western印跡電泳條帶

2.3不同類型患者靶向治療效果分析 男性靶向治療的無進展生存期(7.9個月)與女性(8.2個月)差異無統計學意義(χ2=0.452,P=0.551);CEA升高組(11.2個月)與CEA水平正常組(7.4個月)差異無統計學意義(χ2=1.379,P=0.082)；Cyfra21-1升高組(7.9個月)明顯短于Cyfra21-1正常組(2.3個月；χ2=9.814,P=0.005)；CEA與Cyfra21-1聯合檢測顯示，CEA升高和Cyfra21-1正常組(10.6個月)與CEA升高、Cyfra21-1升高或CEA正常、Cyfra21-1正常(11.9個月)、CEA正常和Cyfra21-1升高者(6.8個月)差異有統計學意義(χ2=7.899,P=0.013)；直接測序法和ARMS法檢測的表皮生長因子受體基因突變患者無進展生存期(12.6、9.8個月)均明顯長于無基因突變患者(8.1、2.2個月；χ2=8.343、17.482,P=0.007、0.000)。

2.4靶向治療效果的預測分析 Cox回歸模型多因素分析顯示，治療前Cyfra21-1水平和表皮生長因子受體突變情況是NSCLC患者靶向治療無進展生存期的獨立影響因素。見表1。

表1 NSCLC患者各因素和無進展生存期的Cox回歸分析

3 討 論

最新版美國NCCN指南中首次提出，對晚期或復發轉移性NSCLC應進行表皮生長因子受體基因突變檢查，對存在突變的患者推薦TKI治療〔2〕。ARMS法檢測敏感度高，直接測序法敏感度低，陽性結果需突變細胞數占總細胞的20%以上〔4〕。CEA存在于癌組織中的黏蛋白，為最常見的腫瘤標志物之一。研究發現，40%～80%的NSCLC能夠檢測出CEA濃度增加，持續性增加常見于進展期〔5〕。但CEA濃度與表皮生長因子受體基因突變的相關性的研究較少，且無定論。本研究提示CEA水平與表皮生長因子受體基因突變存在關聯。而且表皮生長因子基因突變會引發其下游信號分子過度激活，提升抗凋亡作用，促進癌細胞增殖，進而提升CEA蛋白表達。腫瘤標志物是目前早期診斷癌癥和監測療效的主要指標，隨著靶向治療的推廣，發現部分腫瘤標志物含量改變可預測其療效。本研究結果提示雖然Cyfra21-1濃度無法預測表皮生長因子受體基因突變，但可作為NSCLC靶向治療的預后指標。相關研究顯示，CEA可與C-Myc、BCL-2聯合發揮抑癌細胞凋亡的作用，傳統化療NSCLC血清CEA濃度增加預后較差〔6〕；但因CEA與表皮生長因子受體基因突變的相關性，對靶向治療患者，CEA濃度升高預后較好。