電針對阿爾茨海默病大鼠齒狀回星形膠質細胞和白細胞介素-10表達及其共定位的影響

陶一鳴 杜艷軍 田青 王靜芝 孫國杰 沈峰

(1湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，湖北 武漢 430061；2華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院)

老年性癡呆是一種隨著年齡增加持續性發展的神經退行性疾病，又稱阿爾茨海默病(AD)，其臨床特征為認知能力的損傷、行為與人格的改變。β淀粉樣蛋白(Aβ)代謝障礙及異常沉積是 AD的早期事件，是AD病理過程的中心因素〔1〕，星形膠質細胞(AC)介導的神經炎性病變在此過程中有著不可忽視的作用。以往的研究多集中在AC在Aβ刺激下大量分泌促炎性因子而加重AD病理進程〔2，3〕。本研究探討針灸是否調控AC促分泌抑炎性因子白細胞介素(IL)-10而發揮其保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 40只SPF級雄性Wistar大鼠(湖北省實驗動物研究中心)，月齡為(8±2)個月，體重為(380±20)g。適應性喂養在溫度為(22±2)℃的動物室，自然光線，自由飲水，普通飼料(非鋁制品的器皿中存放)。隨機分為對照組、假手術組、模型組和治療組。整個實驗過程嚴格遵守國家科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2主要實驗試劑和儀器 Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀；牙科鉆；微量注射器；華佗牌Φ0.3×25 mm不銹鋼毫針；G6805-Ⅱ型電針治療儀；高速冷凍離心機；熒光正置顯微鏡(Nikon，Japan)；膠質纖維酸性蛋白(GFAP)一抗(美國Abcam公司，ab53554)、IL-10一抗(美國Abacam公司，ab9969)；Alexa Fluor488綠色-山羊抗兔IgG(美國Invitrogen公司，A11008)、Alexa Fluor488紅色-山羊抗小鼠IgG(美國Invitrogen公司，A11001)、10%水合氯醛、4%多聚甲醛等。

1.3動物模型的復制 10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，腦立體定位儀上俯臥固定，保持前后囟同一水平。剪開頭皮暴露前囟，按照大鼠腦立體定位圖譜〔4〕定位海馬區域(前囟后3.3 mm，中線左右各旁開1.5 mm，深度3 mm)，微量注射器緩慢注入5 μl聚集肽的 Aβ1～42(制備法：0.1 mg Aβ1～42單體，二甲基亞砜50 μl溶解后，離心，加入50 μl 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，稀釋配制成1 μg/μl的溶液，37℃水浴箱孵育7 d)，5 min內注射完，靜置3 min，緩慢出針(速度1.0 mm/min)，防止藥物溢出，牙托粉封固，縫合皮膚，造模完成。肌注青霉素G10萬U，連續3 d。

1.4干預方法 治療組于模型復制成功后，參考《實驗針灸學》動物穴位圖譜選取“百會”(GV20，頂骨正中)和“腎俞”(BL23，第2腰椎下兩旁)穴〔5〕，采用0.30 mm×25 mm不銹鋼針灸針，百會向前平刺3～5 mm，腎俞穴稍向內斜刺5 mm，接 G6805-Ⅱ型治療儀(雙側腎俞穴交替選擇)，連續波，頻率5 Hz，強度以大鼠后爪輕微抖動為度。1次/d，每次20 min，每療程連續6 d，療程間隔1 d，共2個療程。對照組與模型組不予電針刺激。假手術組僅在造模過程中注射等量生理鹽水，余步驟同模型組。

1.5動物取材 大鼠經10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠板，行胸腹聯合切口，先暴露腹主動脈，采血針管取血，離心取上清液。再切斷肋骨、膈肌，心臟暴露時從左心室插入灌注針頭，并快速灌入無菌生理鹽水，同時剪開右心耳，沖洗血液至肝臟發白。繼改用4%多聚甲醛灌注固定至大鼠軀干四肢僵硬狀。斷頭取腦，視交叉平面后4 mm冠狀切腦，置于4%多聚甲醛外固定24 h。

1.6免疫組化法 常規石蠟切片脫蠟至水；乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液抗原修復；37℃，用3%H2O2液孵育25 min，置磷酸鹽緩沖液(PBS)中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，適當滴入3%牛血清白蛋白(BSA)均勻覆蓋組織，封閉30 min；一抗4℃孵育過夜，后置PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；吸干，加入二抗，孵育50 min，再置于PBS中搖床洗滌3次，5 min/次；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗終止反應；蘇木精復染，脫水，透明，封片。用顯微鏡采集圖像，每組隨機選取10張400倍視野下圖片，圖片應讓組織填滿整個視野。應用 Image-Pro Plus6.0軟件分析，記錄每張圖片陽性累積光密度值(IOD值)和面積(Area)，用 IOD/Area求得平均光密度值(MOD)。數值越大表示其含量越多，指標陽性表達越強，數值越小表示陽性表達越弱。

1.7免疫雙標法 步驟同免疫組化法，僅二抗滴加異硫氰酸熒光素(FITC)山羊抗兔IgG(綠色熒光)和山羊抗小鼠IgG(紅色熒光)，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。若紅、綠熒光共存的細胞即GFAP和IL-10表達在同一細胞。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組齒狀回區GFAP表達 與假手術組(1.301±0.016)和對照組(1.246±0.035)相比，模型組(2.593±0.022)和治療組GFAP表達均顯著升高(2.528±0.018，P<0.01)；但治療組和模型組間無顯著性差異(P>0.05)。免疫組化圖片也可見，對照組和假手術組齒狀回GFAP陽性神經元表達較少，表現為胞體小，突起細長；模型組和治療組AC數量明顯增多，且胞體大，突起粗，染色深。見圖1。

2.2各組齒狀回區IL-10表達 與假手術組(38.32±3.11)和對照組(36.34±3.23)相比，模型組IL-10陽性表達顯著降低(20.58±6.282，P<0.01)；和模型組相比，治療組IL-10陽性表達顯著增強(30.71±6.45，P<0.01)。IL-10可染色于神經細胞胞核和胞質，在對照組與假手術組的海馬齒狀回均可見呈棕褐色的陽性表達，且細胞核的密度較高，數目較多，輪廓較清晰。模型組細胞排列稀疏，陽性表達數減少；治療組明顯陽性表達細胞增多，且染色偏濃。見圖1。

2.3各組GFAP與IL-10的共定位 紅色為GFAP熒光染色陽性細胞，綠色為IL-10熒光染色陽性細胞。雙標結果顯示，假手術組齒狀回IL-10與GFAP共定位呈金黃色；模型組GFAP突起增多，IL-10主要定位于神經元細胞核；治療組IL-10表達顯著增強，不僅表達在神經元細胞核，也表達在神經元纖維。見圖2。

圖2 各組海馬齒狀回GFAP、IL-10免疫雙標圖(×400)

3 討 論

傳統觀點認為，Aβ主要是由神經元產生的，但近期研究表明AC，特別是在激活狀態下的AC也可以產生Aβ〔6〕，且持續和廣泛的AC激活是AD早期的一種現象〔7〕。AC是中樞神經系統的免疫吞噬細胞，是膠質細胞中功能較全面的一類細胞〔8〕。由于活化 AC是神經炎斑塊的基本成分〔9〕，近年來關于AC、炎性反應與AD間相互關系的研究日趨增多，多集中在AC活化后如何大量釋放促炎性因子、氧自由基等各種有害因子，加重Aβ神經毒性作用和神經元損傷。事實上，AC也具有神經保護作用，如Funato等〔10〕很早證實在非癡呆老年腦AC內，不僅含有Aβ陽性小顆粒，且可通過溶酶體分解Aβ，說明正常情況下AC 具有清除Aβ神經毒性的作用。

IL-10作為免疫炎性調節因子，在維持神經元穩態和能量代謝平衡、細胞存活等方面發揮重要作用〔11〕，IL-10在AD患者血清和腦脊液中的表達水平與Aβ42、Aβ42/磷酸化(p)-tau呈明顯的負相關性〔12,13〕。本研究結果提示Aβ1～42激活了AC，且降低了抑炎性因子IL-10的表達，說明大鼠海馬損傷部位的AC增生可能是對神經細胞損傷的反應〔14〕。

本文表明，在AC沒有激活的狀態下，IL-10沉積于AC。而AD模型大鼠不僅清晰可見AC腫脹，且IL-10已不再與GFAP共定位，主要表達在神經元細胞核。經電針治療后，IL-10的表達顯著增強，不僅表達在神經元細胞核，也表達在神經元纖維，促進了IL-10對神經元的抗炎與保護作用。

海馬齒狀回不僅與學習記憶等認知功能相關，且是神經發生的主要部位〔15〕。本研究提示電針對AD的調節作用不限于抗炎作用，很可能與其發揮類似神經干細胞功能〔16〕、誘導分化神經細胞〔17〕、與神經元的能量代謝耦聯作用〔18〕等有關，其具體機制有待深入研究。