心肌缺血和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊血管新生雙靶點(diǎn)小鼠模型的建立

蔡宏文，陳 晨，李家英，李心遙，陳民利，毛 威

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，杭州 310006；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

冠心病是一種嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)疾病，是當(dāng)前引起死亡的主要病因之一。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病的病理基礎(chǔ)，AS斑塊破裂引起冠脈內(nèi)急性血栓形成是導(dǎo)致冠心病死亡的主要原因，而斑塊內(nèi)血管新生是AS不穩(wěn)定斑塊形成的關(guān)鍵，抑制斑塊內(nèi)血管新生已成為增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，進(jìn)而防治冠心病的一個(gè)新靶點(diǎn)[1-2]。然而，血管新生對(duì)于缺血心肌又是有效的代償機(jī)制，心肌缺血區(qū)的新生血管可建立有效的側(cè)枝循環(huán)，提高心肌耐受缺氧的能力，促進(jìn)心肌缺血區(qū)血管新生是改善冠心病心肌缺血的一項(xiàng)重要手段[3-4]。血管新生一方面是AS斑塊破裂的關(guān)鍵，另一方面它又是改善心肌缺血的有效治療途徑，如何在同一個(gè)體中兼顧兩者的統(tǒng)一，建立理想的心肌缺血和AS斑塊血管新生的雙靶點(diǎn)動(dòng)物模型是展開(kāi)上述研究的關(guān)鍵。迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)心肌缺血區(qū)和斑塊內(nèi)血管新生的雙靶點(diǎn)動(dòng)物模型的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在高脂飲食下，通過(guò)皮下注射異丙腎上腺素造成心肌梗死，成功建立了心肌缺血和AS斑塊內(nèi)新生血管的雙靶點(diǎn)小鼠模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性ApoE-/-小鼠和C57BL/6 J小鼠各10只，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(滬)2017-0005]。動(dòng)物飼養(yǎng)及無(wú)菌手術(shù)均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)小鼠飼養(yǎng)室進(jìn)行[SYXK(浙)2018-0012]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查號(hào)[ZSLL-2017-107]，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸異丙腎上腺素純品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(CAS號(hào)：51-30-9)。CD31 Rabbit mAb購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和模型建立

C57BL/6 J小鼠作為對(duì)照組，模型組為ApoE-/-小鼠，每組10只。對(duì)照組全程飼喂普通飼料，模型組給予高脂飼料(高脂飼料配方：普通小鼠基礎(chǔ)飼料+1.25%膽固醇+15%豬油)。模型組小鼠在高脂飼料喂養(yǎng)8周后，給予異丙腎上腺素100 mg/kg皮下注射，連續(xù)2 d。對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水。兩組繼續(xù)各自飲食喂養(yǎng)4周。

1.3.2 標(biāo)本取材

第12周末，小鼠腹腔注射麻醉后，眼眶靜脈叢取血。常規(guī)消毒，暴露胸腹腔，剪取心臟，將心臟沿短軸面橫切留取心肌組織標(biāo)本，其中模型組按正常心肌組織區(qū)、心肌梗死邊緣區(qū)(心肌缺血區(qū))和心肌梗死區(qū)分別留取標(biāo)本。同時(shí)小心取出主動(dòng)脈，按橫截面分段留存。各組標(biāo)本置入甲醛保存固定，脫水浸蠟包埋，切片備用。

1.3.3 觀察指標(biāo)

(一)血脂測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)以下血脂項(xiàng)目：血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)。

(二)HE染色

觀察主動(dòng)脈橫切面，觀察主動(dòng)脈血管壁、內(nèi)膜的病理結(jié)構(gòu)、斑塊形態(tài)等。觀察心肌組織不同區(qū)域的組織形態(tài)學(xué)變化。

(三)CD31免疫組化染色檢測(cè)心肌組織和主動(dòng)脈斑塊內(nèi)新生血管密度

選用內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD31行免疫組化染色，CD31標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性染色呈棕黃色，采用Carl Zeiss Imaging Systems測(cè)量的陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(mean optical density, MOD)來(lái)反映新生血管的密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組血脂檢測(cè)結(jié)果比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的血清TC、LDL-C水平顯著升高，而HDL-C水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的比較Table 1 The levels of serum TC, TG, LDL-C, and HDL-C in the two groups

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

2.2 兩組主動(dòng)脈HE染色

對(duì)照組主動(dòng)脈HE染色見(jiàn)管壁內(nèi)膜平整、未向管腔突出、無(wú)明顯增厚，中膜平滑肌排列整齊，未見(jiàn)脂肪細(xì)胞沉積，無(wú)斑塊形成。模型組主動(dòng)脈HE染色見(jiàn)血管腔內(nèi)粥樣斑塊形成，內(nèi)皮細(xì)胞排列不完整，內(nèi)膜增厚、斷裂、不平整，內(nèi)皮下見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞增生明顯、排列紊亂，見(jiàn)纖維帽形成。見(jiàn)圖1。

2.3 心肌組織HE染色

對(duì)照組心肌組織HE染色顯示心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)基本一致，細(xì)胞漿中橫紋較清晰，細(xì)胞核多呈橢圓形。模型組HE染色見(jiàn)心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，室壁變薄，心肌細(xì)胞橫紋消失、部分破裂變性、細(xì)胞核模糊，細(xì)胞間可見(jiàn)纖維組織和炎癥細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖1 兩組主動(dòng)脈比較(HE染色,×100)Figure 1 Comparison of aortic tissue in the two groups (HE staining)

2.4 免疫組化染色檢測(cè)兩組主動(dòng)脈新生血管

采用CD31標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性染色呈棕黃色或棕褐色。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組的CD31表達(dá)明顯增多(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

圖2 兩組心肌組織比較(HE染色,×100)Figure 2 Comparison of pathological changes in the myocardial tissue in the two groups (HE staining)

2.5 免疫組化染色檢測(cè)不同部位心肌組織新生血管

將模型組心肌組織分為3組：正常心肌組織區(qū)、心肌梗死區(qū)和心肌缺血區(qū)，分別行CD31染色。結(jié)果顯示：缺血區(qū)的新生血管表達(dá)最豐富；與正常心肌組織區(qū)相比，缺血區(qū)和梗死區(qū)的CD31表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；與梗死區(qū)相比，缺血區(qū)的CD31表達(dá)也顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖4。

表2 兩組主動(dòng)脈新生血管密度比較Table 2 The density of neovascularization in aorta in the two groups

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

圖3 兩組主動(dòng)脈CD31(免疫組化染色,×400)Figure 3 Histology of the control and model mouse arotas(immunohistochemical staining)

不同心肌組織區(qū)Different myocardial tissue zoneCD31 MOD正常心肌區(qū)Normal zone 0.19±0.03心肌梗死區(qū)Infarction zone0.27±0.05*心肌缺血區(qū)Ischemic zone0.37±0.06*△

注：與正常心肌區(qū)相比，*P<0.05；與心肌梗死區(qū)相比，△P<0.05。

Note. Compared with the normal zone,*P<0.05; Compared with the infarction zone,△P<0.05.

圖4 不同部位心肌組織CD31(免疫組化染色,×400)Figure 4 Histological images of different myocardial tissue zones (immunohistochemical staining)

3 討論

血管新生既是AS不穩(wěn)定斑塊形成的關(guān)鍵，又是改善心肌缺血有效的代償途徑[5]。于是問(wèn)題就在于，抑制斑塊內(nèi)血管新生的藥物或者因子，有無(wú)可能同時(shí)抑制缺血心肌區(qū)的血管新生，從而加重心肌缺血？反之，具有促進(jìn)缺血心肌區(qū)血管新生作用的藥物，是否會(huì)加重斑塊內(nèi)血管新生而誘發(fā)斑塊破裂？無(wú)論是抗血管生成的藥物還是促血管生成因子，尤其是臨床上廣泛應(yīng)用的一些抗心肌缺血中藥，都面臨安全性問(wèn)題[6]。因此，在抑制AS斑塊內(nèi)新生血管和促進(jìn)心肌缺血區(qū)側(cè)枝形成的治療策略中，存在著固有的相互制約，必須綜合考慮并兼顧這對(duì)矛盾的平衡和統(tǒng)一[7]。因此，很有必要在同一生物體內(nèi)建立心肌缺血區(qū)和AS斑塊內(nèi)新生血管的雙靶點(diǎn)模型，為進(jìn)一步研究血管新生在心肌缺血區(qū)和AS斑塊內(nèi)兩種不同病理環(huán)境下的發(fā)生機(jī)制提供平臺(tái)，也為有關(guān)藥物干預(yù)的療效和安全性評(píng)價(jià)提供平臺(tái)。目前在進(jìn)行心血管疾病研究，大多是獨(dú)立的急性心肌梗死模型或AS模型，迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)心肌缺血區(qū)和AS斑塊內(nèi)新生血管雙靶點(diǎn)動(dòng)物模型的研究報(bào)道。正是由于缺乏可供研究的動(dòng)物模型，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者多將AS斑塊或缺血心肌內(nèi)的血管新生孤立開(kāi)來(lái)作為獨(dú)立的研究對(duì)象進(jìn)行研究，因而無(wú)法得到全面準(zhǔn)確的研究結(jié)果。因此，建立理想的心肌缺血區(qū)和AS斑塊內(nèi)血管新生的雙靶點(diǎn)動(dòng)物模型是探討血管新生發(fā)生機(jī)制和評(píng)價(jià)安全有效干預(yù)手段的基礎(chǔ)。

基于以上研究目的，本項(xiàng)目選用ApoE-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象構(gòu)建血管新生雙靶點(diǎn)動(dòng)物模型。不同于大鼠、家兔等動(dòng)物，高脂飼喂的ApoE-/-小鼠是目前成熟的AS動(dòng)物模型選擇，其形成的主動(dòng)脈AS斑塊病變較恒定，接近人體病理形態(tài)[8]。構(gòu)建心肌梗死的動(dòng)物模型，目前多采用傳統(tǒng)的開(kāi)胸結(jié)扎法阻斷冠狀動(dòng)脈血流來(lái)完成[9]。但是小鼠體型小，采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制造心梗模型十分困難，該方法對(duì)術(shù)者的要求非常高，需要長(zhǎng)切口開(kāi)胸，出血多、創(chuàng)傷大，動(dòng)物死亡率極高，實(shí)驗(yàn)成功率很低[10]。異丙腎上腺素具有強(qiáng)烈的收縮冠狀動(dòng)脈的作用，同時(shí)能增強(qiáng)心肌收縮力和加快心率增加心肌耗氧，能夠誘發(fā)心肌梗死[11]。皮下注射異丙腎上腺素操作簡(jiǎn)便，對(duì)動(dòng)物損傷小，死亡率低，心肌梗死效果穩(wěn)定可靠。但合適的皮下注射劑量和用藥時(shí)間是造模成功與否的關(guān)鍵。給藥劑量過(guò)大容易導(dǎo)致小鼠死亡，劑量過(guò)低則不容易引起心肌梗死。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇異丙腎上腺素100 mg/kg連續(xù)2 d皮下注射是小鼠不致死又能造成心肌梗死模型的理想給藥方式。本研究發(fā)現(xiàn)，在高脂喂養(yǎng)12周后，模型組血清TC、LDL-C水平顯著高于對(duì)照組，而HDL-C顯著低于對(duì)照組；HE染色發(fā)現(xiàn)模型組主動(dòng)脈形成了典型的AS病理學(xué)改變；在異丙腎上腺素皮下注射4周后，模型組心肌組織HE染色可見(jiàn)典型的心肌梗死鏡下改變。CD31免疫組化染色結(jié)果顯示，模型組主動(dòng)脈新生血管密度顯著高于對(duì)照組；而且模型組心肌缺血區(qū)的新生血管表達(dá)最豐富，顯著高于心肌梗死區(qū)和正常心肌組織區(qū)。

本研究通過(guò)皮下注射異丙腎上腺素干預(yù)ApoE-/-小鼠的實(shí)驗(yàn)方法，在國(guó)內(nèi)外首次成功建立了心肌缺血和AS斑塊內(nèi)新生血管的雙靶點(diǎn)小鼠模型。該方法不需要開(kāi)胸，損傷小、死亡率低、易于操作，為血管新生在不同微環(huán)境下的發(fā)生機(jī)制和藥物干預(yù)的療效及安全性研究提供了一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)又穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型制作方法。