二甲雙胍與順鉑聯合誘導人結腸癌HCT-8細胞凋亡的研究

于敬坤，李明志，隨振陽，張 琪，田 煒，胡 琨,楊光華,張國志,王長友*

(1.華北理工大學附屬醫院普通外科,河北 唐山 063000; 2.華北理工大學醫學實驗研究中心,河北 唐山 063000)

結腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，在我國，其發病率及死亡率均高于世界水平，無數患者飽受結腸癌病痛的折磨[1]。目前，我國治療結腸癌的主要方式包括外科手術切除及以其為基礎的綜合治療、化學藥物治療、放射治療、新輔助放化療等；但我國結直腸癌患者術后5年生存期依然徘徊在60%左右。二甲雙胍(metformin)是臨床上常用的降糖藥物，但有相關病例對照研究資料表明，二甲雙胍的使用與惡性腫瘤發生風險的下降具有一定相關性，二甲雙胍使用時間的延長及使用次數的增加，可使惡性腫瘤的發病風險降低[2-3]。凋亡是細胞生長增殖過程中重要的調節方式，在腫瘤細胞的發生、發展及死亡過程中發揮著重要作用。該實驗研究二甲雙胍聯合順鉑對HCT-8人類結腸癌細胞的影響，并探究其機制，為二甲雙胍優化化療方案提供實驗依據及理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

HCT-8人類結腸癌細胞獲贈于華北理工大學醫學實驗研究中心分子診斷實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM完全培養基(賽默飛世爾[蘇州]儀器有限公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物公司)；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(美國Gibco)；鹽酸二甲雙胍(北京索萊寶科技有限公司)；順鉑注射液(江蘇豪森藥業股份有限公司)；MTT試劑盒、caspase-3(激活型)抗體、HRP標記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術研究所)；96孔板、6孔板(德國Eppendorfna)；顯微鏡(日本Nikon Eclipse TS100)；酶標儀、顯影儀、電泳轉膜相關器材(上海Bio-Rad公司)；Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt、Gsk-3、p-Gsk-3 抗體(Cell Signaling)；GAPDH抗體(天徳悅[北京]生物科技有限責任公司)；流式細胞儀及FITC偶聯Annexin V凋亡檢測試劑盒I(美國BD公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、約90% DMEM完全培養基的細胞培養液培養HCT-8人類結腸癌細胞，并置于37℃恒溫、95%O2、5%CO2空氣孵箱中(相對濕度為95%)。細胞生長密度達80%以上時，可1∶2或1∶3傳代(傳代時間約為2～3 d)，HCT-8細胞呈單層貼壁生長，待形成致密單層細胞時，可利用胰酶消化，取狀態良好的對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 MTT實驗檢測細胞增殖能力

將HCT-8人類結腸癌細胞均勻地播種在96孔板中(每孔約104個細胞)，待細胞完全貼壁后，分別用含有不同濃度鹽酸二甲雙胍(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL)、不同濃度順鉑(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg/mL)的細胞培養液培養；培養 24、48、72 h后移除細胞培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩次。每孔加入了100 μL的的單純細胞培養液及10 μL濃度為5 mg/mL的MTT試劑；將96孔板置于恒溫箱內孵化，待紫藍色結晶完全形成后移除細胞培養液，然后加入100 μL的二甲基亞砜溶液(DMSO)，輕輕晃動使結晶完全溶解，并用酶標儀測定各孔在490 nm波長下的吸光值。注意設置空白對照組。

根據MTT劑量依賴性實驗結果，1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑對HCT-8細胞具有抑制作用，且在有效抑制范圍內，便于調控，因此可采用1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑作為后續實驗的藥物濃度，設置二甲雙胍組(MET)、順鉑組(DDP)、二甲雙胍聯合順鉑組(MET+DDP)、空白對照組(CK)4組，繼續行MTT實驗，觀察HCT-8細胞24、48、72 h的增殖能力，并判斷兩種藥物的協同作用。

藥物協同作用效能用協同指數(combined index,CI)來表示，采用金正均法(概率相加法)計算：

EA+B=EA+EB-EA×EB

其中EA代表A藥單獨作用時的效應；EB是B藥單獨作用時的效應；EA+B是A藥與B藥聯合作用時的效應，為聯合用藥效應的期望值。

虛擬仿真實驗技術是指以計算機網絡為核心，利用多媒體技術虛擬實驗環境進行人機交互和仿真，學生利用虛擬實驗教學平臺，可在模擬的真實環境中完成實驗項目，該實驗技術已經在醫藥院校逐步應用[4-5]。2013年8月教育部發布教高司函〔2013〕94號文件，在全國開展“國家級虛擬仿真實驗教學中心”的認定工作，文件提出將現代信息技術整合至教學應用中，從國家層面確認了對網絡化虛擬學習的認可[6]。虛擬實驗教學已經迅速發展成為現代實驗教學的重要方式之一，這種教學模式可以培養學生的實踐能力和創新能力，提高應用型人才培養的質量。

Q=EA+B÷(EA+EB-EA×EB)

Q值的意義：0.85-1.15為效應單純相加；1.15-20為效應增強；>20為效應顯著增強；0.85-0.55為效應拮抗；<0.55為相應明顯拮抗(協同作用：兩種以上藥物聯合應用時，如各藥物的作用方向一致為協同作用；反之成為拮抗作用；當Q值≥0.85時，即兩種藥物具有協同作用)。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡比例

將HCT-8人類結腸癌細胞均勻地播種在6孔板中并培養，密度達70%～80%時分別給予含1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍(MET組)、20 μg/mL順鉑(DDP組)、1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍及20 μg/mL順鉑(MET+DDP組)、不含藥物(CK組)的細胞培養液2 mL繼續培養， 48 h后移除細胞培養液，各組均收集約106個細胞于5 mL試管內；試管內加入400 μL的1X Binding Buffer及5 μL FITC Annexin V，室溫孵化15 min后加入5 μL PI，在流式細胞儀中檢測各組細胞的凋亡比例，并計算聯合用藥的協同指數。

1.3.4 Western blotting觀察HCT-8人類結腸癌細胞Bcl-2、Bax、caspase-3(激活型)以及AKT/GSK-3 通路蛋白的表達水平

將HCT-8人類結腸癌細胞同上分組并培養，48 h后用預冷的PBS洗滌細胞3次，每孔內加入100 μL含有1%PMSF的組織細胞裂解液，冰上裂解30 min后刮下細胞并在預冷的低溫高速離心機中離心15 min(14000 r/min)，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度并變性，依次制備8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉轉膜將蛋白轉到硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫下封閉液(5% 脫脂奶粉、0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1% 吐溫20、pH 7.5)封閉2 h，TBST(0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1% 吐溫20、pH 7.5)洗膜3次后，4℃敷一抗過夜，TBST洗膜3次后加入二抗孵化2 h，TBST洗凈二抗，加入顯影劑在顯影儀內顯影，以GAPDH為內參蛋白，在內參平齊的前提下，觀察各組細胞中各蛋白的表達。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 MTT檢測細胞增殖能力

2.1.1 鹽酸二甲雙胍及順鉑對HCT-8人類結腸癌細胞增殖能力、相對增殖能力的影響

在不同濃度鹽酸二甲雙胍作用下，24 h時HCT-8人類結腸癌細胞在鹽酸二甲雙胍濃度下約0～2.00 mg/mL范圍內，出現細胞增殖強于無藥物干預(可能由于藥物誘發細胞應激性增殖)，藥物濃度高于2 mg/mL時，HCT-8細胞增殖能力隨藥物濃度升高而逐漸遞減；48、72 h時，在鹽酸二甲雙胍濃度為0～4.50 mg/mL范圍內，HCT-8細胞的增殖能力總體上與藥物濃度呈負相關關系，隨著鹽酸二甲雙胍藥物濃度的增高，細胞增殖能力隨之遞減(圖1)。在不同濃度順鉑作用下，24 h時HCT-8細胞的增殖能力與順鉑藥物濃度呈負相關；48、72 h時HCT-8細胞增殖能力均在一定濃度范圍內隨順鉑濃度增高而降低，48 h順鉑濃度約高于30 μg/mL、72 h順鉑濃度約高于15 μg/mL時，HCT-8細胞增殖能力不隨順鉑濃度增高而發生明顯改變(圖2)。在鹽酸二甲雙胍及順鉑作用下，HCT-8細胞的相對增殖能力隨著作用時間的延長(相對增殖能力=某一時間內實驗組的細胞增殖能力/同時刻對照組的細胞增殖能力×100%；相對增殖能力可反映細胞增殖受抑制程度)，總體上表現為遞減趨勢(圖1、圖2)。

圖1 鹽酸二甲雙胍對HCT-8人類結腸癌細胞增殖能力及相對增殖能力的影響Figure 1 The effect of metformin hydrochloride on proliferation and relative proliferation ability of human colon cancer HCT-8 cells

圖2 順鉑對HCT-8人類結腸癌細胞增殖能力及相對增殖能力的影響Figure 2 The effect of cisplatin on proliferation and relative proliferation ability of human colon cancer HCT-8 cells

MTT檢測HCT-8人類結腸癌細胞在1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯合作用24、48、72 h時的細胞增殖能力；如表1，鹽酸二甲雙胍組(MET)、順鉑組(DDP)及聯合用藥組(MET+DDP)的細胞增殖能力要弱于空白對照組(CK)，聯合用藥組(MET+DDP)的細胞增殖能力明顯低于其它3組(P<0.05)。藥物協同指數(CI)Q值在藥物作用24、48、72 h時均大于0.85，提示MET+DDP的聯合抗HCT-8細胞增殖能力的作用強于MET組、 DDP組。

1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯合用藥作用于HCT-8人類結腸癌細胞48 h時(圖3)，對照組的HCT-8細胞體積較小，排布密集，形態較為規整，可見分裂核；順鉑組較對照組細胞體積增大明顯，多核細胞比例增多；二甲雙胍組較對照組，細胞體積增大，胞質空泡化明顯；聯合用藥組細胞既體積增大明顯，胞質又出現空泡化。

2.2 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯合用藥對HCT-8人類結腸癌細胞凋亡的影響

DDP組、MET組、MET+DDP組、CK組四組的總凋亡比例分別是(19.7267±0.2043)%、(16.2567±1.3258)%、(33.7567±0.7182)%、(10.3667±0.1301)%；本實驗中，當1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯合用藥作用于HCT-8人類結腸癌細胞48 h時(圖4)，均可引起HCT-8細胞的總凋亡比例上升(對比CK組，并具有統計學差異，P<0.05)；MET+DDP組HCT-8細胞的總凋亡比例最高，且均強于MET組、DDP組及CK組，P<0.05。MRT+DDP組促HCT-8細胞凋亡的協同指數為1.0299>0.85，提示1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍與20 μg/mL順鉑對促進HCT-8細胞具有協同作用。

2.3 Western blotting 檢測藥物作用48 h時相關蛋白的表達活性

2.3.1 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20μg/mL順鉑及聯合用藥影響HCT-8人類結腸癌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達

Bcl-2的活性在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內依次為(1.0383±0.1496)、(0.8422±0.1228)、(0.6507±0.1493)、(0.4629±0.1315)，4組間彼此存在統計學差異，且呈遞減趨勢，P<0.05；而Bax的活性在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內依次為(0.5714±0.1226)、(0.7379±0.1108)、(0.9001±0.1008)、(1.1355±0.1302)，4組間也彼此存在統計學差異，且呈遞增趨勢，P<0.05；Bax/Bcl-2值在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內分別是(0.6398±0.1988)、(0.8887±0.1505)、(1.2557±0.1943)、(1.9982±0.3168)，依次遞增，并具有統計學意義，P<0.05(圖5)。

2.3.2 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20μg/mL順鉑及聯合用藥影響HCT-8人類結腸癌細胞凋亡相關蛋白caspase-3(激活型)的表達藥物作用48 h時，caspase-3(激活型)的表達在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內分別是(0.5701±0.0535)、(0.7288±0.0855)、(0.8302±0.0506)、(0.9347±0.0902)，且caspase-3(激活型)的表達呈依次遞增的趨勢，并具有統計學意義，P<0.05(圖6)，提示在MET+DDP組HCT-8細胞中無凋亡促進活性的p-caspase-3進行蛋白剪切形成具有促凋亡活性的caspase-3(激活型)的比例增高。

表1 鹽酸二甲雙胍聯合順鉑對HCT-8人類結腸癌細胞增殖能力的影響(OD值)Table 1 The effect of metformin hydrochloride combined with cisplatin on the proliferation capacity of human colon cancer HCT-8 cells (OD value)

注：與DDP組相比，*P<0.05；與MET組相比，#P<0.05；與MET+DDP組相比，※P<0.05；與CK組相比，&P<0.05。

Note: Compared with the DDP group,*P< 0.05.Compared with the MET group,#P< 0.05.Compared with the MET+DDP group,※P< 0.05. Compared with the CK group,&P< 0.05.

注：DDP、MET、MET+DDP、CK四組給予相應處理48 h后各組細胞的形態學改變。圖3 DDP、MET、MET+DDP、CK 各組HCT-8細胞于培養48 h的細胞觀察(×200)Note. The morphological changes of HCT-8 cell in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups were given corresponding treatment for 48 h.Figure 3 Observation of the HCT-8 cells in DDP, MET, MET+DDP and CK groups after 48 h

注：DDP、MET、MET+DDP、CK四組相比較，*P<0.05。圖4 鹽酸二甲雙胍聯合順鉑作用于HCT-8人類結腸癌細胞48 h時對其凋亡的影響Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, *P< 0.05.Figure 4 Effect of metformin hydrochloride combined with cisplatin on apoptosis in the HCT-8 human colon cancer cells at 48 h after treatment.

2.3.3 1.5 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯合用藥影響HCT-8人類結腸癌細胞AKT/GSK-3β通路蛋白的表達

AKT/GSK-3β通路蛋白在CK、MET、DDP、MET+DDP 各組內的活性如圖7所示，AKT、GSK-3β在4組內表達活性無明顯差異，P>0.05；p-AKT、p-GSK-3β在CK、MET、DDP、MET+DDP 4組內分別表達為(1.0928±0.1182)、(0.8350±0.0579)、(0.7247±0.0500)、(0.6021±0.0447)及(1.0167±0.0669)、(0.8467±0.1017)、(0.6899±0.0680)、(0.5551±0.0710)，且均表現為依次遞減趨勢，并具有統計學意義(P<0.05)。

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四組相比較，* P<0.05，# P<0.05，&P<0.05。圖5 DDP、MET、MET+DDP、CK各組HCT-8人類結腸癌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, * P < 0.05,# P<0.05,& P<0.05.Figure 5 Expression of Bcl-2 and Bax of HCT-8 human colon cancer cells in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四組相比較，* P<0.05。圖6 DDP、MET、MET+DDP、CK各組HCT-8人類結腸癌細胞凋亡相關蛋白caspase-3(激活型)的表達活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, *P < 0.05.Figure 6 Expression of caspase-3 (activated) in the human colon cancer HCT- 8 cells of the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四組相比較，*P<0.05，# P<0.05。圖7 DDP、MET、MET+DDP、CK各組HCT-8人類結腸癌細胞AKT/GSK-3β通路蛋白的表達活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, * P<0.05,# P<0.05.Figure 7 Protein expression of AKT/GSK-3β signaling pathways in the human colon cancer HCT-8 cells in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

3 討論

結腸癌是我國第6大高發惡性腫瘤，在癌癥死亡患者中排第5位[4]；主要是由長期不合理飲食、腸道慢性病惡變、遺傳等因素引起，近年來逐漸趨于青少年發展[5-6]，相關研究指出肥胖患者及糖尿病患者結腸癌的發病風險會高于正常人[7-9]。鉑類藥物(platinum drugs)是治療結腸癌的重要化療藥物，具有較高的抗腫瘤效能，諸多基礎實驗及臨床研究已證明單用或聯合應用鉑類藥物均有明顯的抗腫瘤作用[10-13]。順鉑(cisplatin、DDP)是第一代鉑類藥物，屬于細胞周期非特異性藥物，可通過抑制細胞核分裂使癌細胞生長周期受抑制[14]，但胞質受影響較小，因此可出現胞體增大現象。實驗中順鉑可明顯降低HCT-8人類結腸癌細胞的增殖能力，并存在劑量及時間依賴性。但順鉑也有明顯的不良反應，如惡心、嘔吐等消化道反應及腎毒性、神經毒性、骨髓抑制、過敏反應、心肺功能異常等，減少順鉑用藥可減少不良反應的發生或減輕不良反應的程度[15]；另外，隨著順鉑等鉑類藥物的使用，腫瘤細胞耐藥性也會逐漸增強[16]。因此聯合用藥、減少順鉑的使用成為現代醫學研究的重點之一。二甲雙胍是臨床上的一線降糖藥物。隨著對其研究的不斷深入，部分學者提出二甲雙胍具有降低腫瘤發生風險的作用[17-19]；有實驗表明二甲雙胍可能通過促進胞內脂類物質代謝、調節機體內分泌水平、抑制血小板亢進及降低血液高凝狀態等途徑，抑制腫瘤細胞的發生、發展[20]；在一定藥物范圍內，隨著鹽酸二甲雙胍濃度的增高及作用時間的增加，HCT-8人類結腸癌細胞的增殖能力也隨之降低，表明二甲雙胍可抑制HCT-8細胞的生長、增殖，并存在劑量、時間依賴性(圖1)。且二甲雙胍與順鉑具有一定的協同效果，二者聯合用藥時，HCT-8細胞的增殖能力均明顯弱于單藥使用，提示二甲雙胍可減少化療藥物的使用劑量，優化化療方案。

凋亡是細胞生長增殖過程中重要的調節方式，可主動清除衰老、破損、具有異常功能及潛在危險的細胞，如有癌變危險且自身又無法修復逆轉的細胞等[21]。胞質空泡化是細胞凋亡的重要表現形式，二甲雙胍可使HCT-8人類結腸癌細胞出現胞質空泡化，可見二甲雙胍具有促進HCT-8細胞凋亡的潛能[22]。流式細胞術檢測結果(圖4)提示，1.50 mg/mL鹽酸二甲雙胍、20 μg/mL順鉑及聯合用藥可增強HCT-8細胞的凋亡，并且聯合用藥引起HCT-8細胞的凋亡比例明顯高于單藥使用。細胞凋亡的調控信號通路主要分為外在信號通路(細胞表面死亡受體途徑)及內在信號通路(線粒體凋亡通路)[22-23]。Bcl-2家族蛋白是調控細胞凋亡的關鍵因子，主要調控內在凋亡途徑，作用靶點是線粒體[24]。Bcl-2是Bcl-2家族中典型的抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，二者協同發揮作用，通過改變線粒體外膜的通透性、改變線粒體形態、影響膜間隙蛋白釋放及caspase級聯活化等途徑影響細胞凋亡過程[25]。HCT-8細胞在二甲雙胍、順鉑作用下，促凋亡蛋白Bax活性明顯增高，抑凋亡蛋白Bcl-2活性降低，Bax/Bcl-2值明顯增高，表明二甲雙胍及順鉑均可通過調控線粒體凋亡途徑促進HCT-8細胞的凋亡，且二者聯合作用時，Bax/Bcl-2值較單藥作用結果均明顯增高，說明聯合用藥可能調控線粒體凋亡途徑作用更強。

天冬氨酸特異性蛋白酶(caspases)是另一組與細胞凋亡密切相關的蛋白酶家族，在細胞凋亡最終途徑的調控中具有關鍵作用[26]。caspase-3(激活型)是重要的凋亡效應因子，是凋亡的執行蛋白、凋亡關鍵的蛋白酶[27]；正常細胞中的caspase-3是以無活性的p-caspase-3存在的，在一定條件下，p-caspase-3可通過蛋白剪切形成具有活性的caspase-3(激活型)，從而誘發級聯放大效應，促進細胞凋亡。在MET、DDP、MET+DDP組中，HCT-8人類結腸癌細胞的caspase-3(激活型)活性均高于CK組，且MET+DDP組的caspase-3(激活型)活性也高于其他各組，再次說明二甲雙胍與順鉑具有協同促HCT-8細胞凋亡作用。 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)是細胞內重要的通路蛋白，可廣泛參與細胞的生理病理過程，其活性表達形式p-AKT(磷酸化AKT)可以通過促進絲氨酸/蘇氨酸殘基底物磷酸化從而發揮促進細胞增殖、抑制凋亡作用[28-29]；糖原合成激酶-3β(GSK-3β)是AKT的直接作用底物之一，p-AKT可以與GSK-3β直接結合，改變其Ser9位點結構，使GSK-3β發生磷酸化修飾，從而抑制GSK-3β活性[30]。鹽酸二甲雙胍、順鉑分別作用于HCT-8人類結腸癌細胞后，腫瘤細胞內AKT、GSK-3β活性相對恒定不變，p-AKT、p-GSK-3β活性明顯降低，說明二甲雙胍及順鉑均可能通過抑制AKT/GSK-3β信號通路實現促凋亡作用；當鹽酸二甲雙胍聯合順鉑作用于HCT-8細胞時，p-AKT、p-GSK-3β的活性較單藥作用減弱，表明聯合用藥可協同加強對AKT/GSK-3β信號通路的抑制作用。

綜上，二甲雙胍、順鉑可能通過調控AKT/GSK-3β/Bcl-2家族蛋白通路促進HCT-8人類結腸癌細胞的凋亡，并促進p-caspase-3轉化為caspase-3(激活型)；二甲雙胍與順鉑對HCT-8細胞凋亡具有協同作用，聯合用藥促凋亡作用強于單藥作用。