電離輻射致認(rèn)知功能損傷大鼠模型的研究

劉夢(mèng)雅，袁 慧，高 潔，王永麗，尹晶晶，王新鋼，劉 歡，李建國(guó)，秦秀軍

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030006)

目前，全球頭頸部及原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤人數(shù)逐年增多，放射治療仍是其主要治療手段，但放射治療在損傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)不可避免的損傷照射范圍內(nèi)正常組織，引起認(rèn)知功能損傷[1]。認(rèn)知功能障礙可表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶、思維、信息加工處理、推理、判斷、語(yǔ)言表達(dá)等方面異常，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。電離輻射致認(rèn)知功能損傷動(dòng)物模型的建立可以對(duì)其發(fā)病機(jī)制、輻射防護(hù)劑的研制等的研究提供研究基礎(chǔ)。認(rèn)知功能損傷模型的建立方法很多，包括化學(xué)物質(zhì)損傷、物理?yè)p傷、轉(zhuǎn)基因鼠模型以及老化鼠模型等[2]，本次研究主要根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室照射條件，在不同劑量照射后通過(guò)一系列指標(biāo)對(duì)模型建立進(jìn)行評(píng)估，以此來(lái)判斷模型建立的條件，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，5～6周齡，20只，體重140～170 g，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(軍) 2012 -0004]，合格證號(hào)：0035516；動(dòng)物飼養(yǎng)管理于中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP 中心屏障環(huán)境中，使用許可證號(hào)[SYXK(晉) 2013-0002]，按照中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP 中心實(shí)驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。動(dòng)物經(jīng)6 d檢疫后，按照體重隨機(jī)分為對(duì)照組(Control，C group)、10 Gy照射組(10 Gy IR group)、20 Gy照射組(20 Gy IR group)、30 Gy照射組(30 Gy IR group)，每組5只動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)輻射防護(hù)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[IACUC201603-02]。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，參與實(shí)驗(yàn)者以“3R原則”作為指導(dǎo)原則，并給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

GSH、MDA、8-OHdG檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；Elekta Synergy型直線加速器：英國(guó)Elekta有限公司；Morris水迷宮：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所； SN25776型酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；Histocentre 3型石蠟包埋機(jī)：英國(guó)Shandon公司；Finesse 325型石蠟切片機(jī)：英國(guó)Shandon公司；Excelsior全自動(dòng)組織脫水機(jī)：英國(guó)Shandon公司；BX53型熒光顯微成像系統(tǒng)：日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 照射條件及方法

將已麻醉的 SD 大鼠固定于泡沫板上，用X射線模擬機(jī)進(jìn)行定位，照射部位為頭部，身體其他部分用低熔點(diǎn)鉛模具遮蔽，于山西大醫(yī)院放療科給予劑量率為3 Gy/min的6 MeV電子線照射，大鼠背部面向放射源，源皮距1.0 m，分別按照10 Gy、20 Gy、30 Gy的照射劑量進(jìn)行單次照射，照射完成后送回動(dòng)物，并于中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP 中心動(dòng)物房統(tǒng)一飼養(yǎng)管理。

1.3.2 大鼠發(fā)病情況觀察

在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，觀察記錄大鼠的發(fā)病情況及生存期。

1.3.3 Morris水迷宮試驗(yàn)[3]

照射后一個(gè)月進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)(Morris water maze, MWM)，Morris水迷宮由黑色內(nèi)壁圓柱形水池和一個(gè)位置可移動(dòng)和高度可調(diào)節(jié)的塑料站臺(tái)組成。直徑100 cm，高50 cm，池內(nèi)水深30 cm，加熱器將水加熱在(21±2)℃左右。水池標(biāo)有東、南、西、北四個(gè)入水點(diǎn)，并將水池分為東北(NE)、東南(SE)、西北(NW)、西南(SW)四個(gè)象限，在SE象限正中距池邊緣20 cm處放一逃避平臺(tái)，平臺(tái)高29 cm,直徑為10 cm，此平臺(tái)表面有凸起便于動(dòng)物站立，池中水沒(méi)過(guò)平臺(tái)1 cm左右，水池內(nèi)池壁有各種圖案為動(dòng)物提供空間參照線索，便于大鼠定位平臺(tái)，水迷宮上方放置攝像機(jī)，計(jì)算機(jī)內(nèi)安裝軟件對(duì)大鼠游泳軌跡進(jìn)行跟蹤記錄，完成后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation test)，在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天將大鼠放入未放置平臺(tái)的水池中自由游泳2 min，熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境。定位航行實(shí)驗(yàn)周期為5 d，每天訓(xùn)練1個(gè)時(shí)段，每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)象限的4個(gè)入水點(diǎn)入水，訓(xùn)練前將平臺(tái)放在SE象限中，將大鼠面向池壁從入水點(diǎn)放入池中，對(duì)大鼠的游泳軌跡進(jìn)行跟蹤記錄，并記錄其從入水到爬到平臺(tái)(四肢均在平臺(tái)上)的時(shí)間，此時(shí)間即為逃避潛伏期(escape latency，LT)。讓大鼠在平臺(tái)上休息數(shù)秒后放回籠中。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員將其引至平臺(tái)，其逃避潛伏期記為120 s。每一時(shí)間段內(nèi)4次逃避潛伏期的算數(shù)均數(shù)作為這一時(shí)間段的成績(jī)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test)在定位航行實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行，即第6天撤去平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入池中，記錄1 min內(nèi)大鼠的游泳軌跡并進(jìn)行分析。觀察分析其穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)，記錄大鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)間、平臺(tái)象限游泳距離及穿越平臺(tái)次數(shù)，以檢測(cè)大鼠的空間記憶能力。

1.3.4 氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠在照射30 d后處死取出腦組織，稱取200 mg，放入潔凈的勻漿管中，加入預(yù)冷的0.9%的生理鹽水，將組織放在冰上剪碎、勻漿，2500 r/min離心10 min，收集上清液分裝，-20℃中保存?zhèn)溆谩７謩e嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA、GSH和8-OHdG含量。

1.3.5 病理切片制作方法及HE染色

(1)制片：修取大腦，按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及HE染色。(2)脫水及包埋：取組織，經(jīng)自來(lái)水沖洗固定液，酒精梯度脫水后(70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ)，對(duì)組織進(jìn)行透明(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ)，浸蠟(石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ)后包埋。(3)切片：包埋后的組織3～5 μm切片，經(jīng)60℃烤片后染色。(4)染色：HE染色(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟、過(guò)100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ、80%、70%的梯度酒精，蘇木素染色、分化、反藍(lán)、伊紅染色、過(guò)70%、80%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精)。(5)透明及封片：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后樹(shù)膠封片，待鏡檢。之后對(duì)每組大鼠的大腦切片進(jìn)行光鏡檢查、拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠照射后一般狀態(tài)觀察

圖1 不同劑量照射后大鼠生存曲線Figure 1 Survival curves of the rats after irradiation at different doses

照射后觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在照后第2天30 Gy IR組有動(dòng)物發(fā)生背毛不整齊，流涎等癥狀，照后第3天死亡。如圖1各組別生存曲線可以看出照后30天時(shí)，C組未見(jiàn)動(dòng)物死亡，10 Gy IR組和20 Gy IR組動(dòng)物死亡率為20%，30 Gy IR組動(dòng)物死亡率為40%。由于單純照射大鼠頭部，故在照后各劑量組大鼠頭頸部出現(xiàn)不同程度的脫毛現(xiàn)象，結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出30 Gy IR組大鼠頭頸部出現(xiàn)嚴(yán)重的脫毛現(xiàn)象。

2.2 不同劑量照射后Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，從表中可以看出，時(shí)間因素(day)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明逃避潛伏期有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)；但時(shí)間和分組的交互作用沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明時(shí)間因素的作用不隨著分組的不同而不同。個(gè)體間變異部分的計(jì)算結(jié)果顯示，分組的P值小于0.05，說(shuō)明分組因素起作用，各組潛伏期指標(biāo)總體而言不同。30 Gy IR組在1～5 d的訓(xùn)練期中，潛伏期時(shí)間均高于其余三組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

第6天空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，30 Gy IR組較C組原平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著縮短(P<0.05)；穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)；10 Gy IR組、20 Gy IR組、30 Gy IR組原平臺(tái)象限游泳距離較C組均顯著縮短(P<0.05)，且隨著劑量的增加，原平臺(tái)象限游泳距離逐漸縮短。

2.3 不同劑量照射對(duì)腦組織中內(nèi)源性抗氧化劑和氧化損傷的影響

從表3中可以看出，四組間的GSH、8-OHdG、MDA差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.718、2.918、2.617，P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，與C組相比，10 Gy IR、20 Gy IR和30 Gy IR組大鼠腦組織中GSH濃度降低，且30 Gy IR組與C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與C組相比，10 Gy IR、20 Gy IR和30 Gy IR組8-OHdG、MDA濃度均升高，其中20 Gy IR和30 Gy IR組與C組MDA濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，30 Gy IR組與C組8-OHdG濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 不同劑量照射后大鼠頭頸部出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象Figure 2 Hair loss occurred at the head and neck of rats after irradiation at different doses

分組Groups不同時(shí)間逃避潛伏期(s)Escape latency at different times第1天 Day1第2天Day2第3天Day3第4天Day4第5天Day5Control group61.79±31.8330.17±13.8712.07±4.7310.22±3.536.35±1.4810 Gy IR group76.42±23.7327.05±10.2311.69±6.7416.50±11.449.36±6.2520 Gy IR group81.12±29.4415.18±9.356.11±1.699.25±3.888.06±6.3630 Gy IR group95.51±23.4165.52±31.60*32.73±23.50*29.52±8.68*20.80±9.16*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表2 不同照射劑量組大鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 2 Comparison of results of spatial exploration in the Morris water maze in rats with different doses of irradiation

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表3 不同照射劑量組大鼠GSH、SOD、MDA、8-OhdG濃度比較Table 3 Comparison of GSH, MDA, and 8-OhdG concentrations in the rats irradiated at different doses of irradiation

注：與C組比較,aP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP<0.05.

注：A：正常細(xì)胞形態(tài)；B：10 Gy IR組細(xì)胞形態(tài)；C：20 Gy IR組細(xì)胞形態(tài)D：30 Gy IR組細(xì)胞形態(tài)；圖中實(shí)線箭頭所指為凋亡小體，虛線箭頭所指為空染區(qū)。圖3 不同照射劑量組大鼠大腦病理組織學(xué)改變(HE，×200)Note. A shows normal cell morpholo Gy; B shows 10 Gy IR group cell morphology; C shows 20 Gy IR group cell morphology; D shows 30 Gy IR group cell morphology; the solid arrows in the figure refer to apoptotic bodies, and the dotted arrow indicates empty stained area.Figure 3 Histopathological changes in the brain tissues of rats after different doses of irradiation(HE staining)

2.4 不同劑量組照射后大鼠大腦海馬CA3區(qū)的病理改變

HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察顯示：C組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞基本觀察不到凋亡、壞死等病理改變，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞連接緊密，且排列整齊。照射后大部分椎體層細(xì)胞胞漿皺縮、深染，細(xì)胞數(shù)量減少，層次紊亂，排列無(wú)序，稀疏、松散，細(xì)胞連接不緊密。10 Gy IR組(B)個(gè)別椎體層內(nèi)細(xì)胞可見(jiàn)凋亡小體，少量神經(jīng)細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)消失。20 Gy IR組(C)和30 Gy IR組(D)組織結(jié)構(gòu)破壞較10 Gy IR組更加嚴(yán)重，出現(xiàn)組織細(xì)胞凋亡、壞死等顯著的病理改變。且30 Gy IR組(D)出現(xiàn)空染區(qū)，可見(jiàn)多個(gè)凋亡小體。

3 討論

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)腫瘤治療技術(shù)的快速發(fā)展，適形放療、伽瑪?shù)丁-刀等放射治療手段的應(yīng)用延長(zhǎng)了患者生存期，但與此同時(shí)，對(duì)周圍正常細(xì)胞的照射會(huì)引起正常組織不可逆損傷，進(jìn)而引起頭頸部腫瘤患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[4]，降低了患者的生存質(zhì)量。有研究表明海馬在人體大腦內(nèi)主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶功能，電離輻射可以通過(guò)損傷海馬的神經(jīng)元細(xì)胞使人海馬依賴性的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能受損[5-6]。而進(jìn)一步研究顯示海馬區(qū)神經(jīng)再生障礙目前被認(rèn)為是輻射致認(rèn)知功能損傷的主要原因[7]，但機(jī)制尚不明確。電離輻射致認(rèn)知功能損傷動(dòng)物模型的成功建立是進(jìn)一步研究損傷機(jī)制、預(yù)防治療手段的重要基礎(chǔ)。

水迷宮實(shí)驗(yàn)是空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，可以評(píng)價(jià)動(dòng)物的空間記憶能力，以此來(lái)判斷認(rèn)知功能相關(guān)腦功能區(qū)是否受到損傷，Rola等[7]利用5 Gy X射線對(duì)21日齡雄性小鼠進(jìn)行全顱照射后發(fā)現(xiàn)，照后1個(gè)月和3個(gè)月，水迷宮測(cè)試空間記憶能力明顯減退，表明幼年小鼠大腦經(jīng)照射后會(huì)對(duì)認(rèn)知功能造成遠(yuǎn)期傷害。另外，電離輻射對(duì)機(jī)體的損傷主要通過(guò)間接作用，即作用于機(jī)體大分子，使其發(fā)生電離，產(chǎn)生活性氧(ROS)，當(dāng)ROS產(chǎn)生量大于機(jī)體可承受抗氧化能力后，會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[8]，因此與氧化應(yīng)激相關(guān)的產(chǎn)物及內(nèi)源性抗氧化物的濃度變化可間接反映大腦經(jīng)照射后受損傷程度。電離輻射作用于機(jī)體的同時(shí)，機(jī)體組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化，不同部位會(huì)發(fā)生相應(yīng)的組織病理?yè)p傷[9]，故病理組織切片的觀察也是判斷損傷的重要指標(biāo)之一。本次研究對(duì)大鼠腦部進(jìn)行不同劑量照射后，通過(guò)檢測(cè)以上指標(biāo)，對(duì)建立的電離輻射致認(rèn)知功能損傷動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估，選擇合適的照射劑量建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

在本次實(shí)驗(yàn)中，選擇三個(gè)劑量進(jìn)行模型建立，通過(guò)觀察動(dòng)物照射后的一般狀態(tài)、死亡率，空間記憶能力、病理組織切片和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)、發(fā)現(xiàn)單次30 Gy照射成功引起了大鼠空間記憶能力的受損。氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明30 Gy使機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑減少，氧化損傷產(chǎn)物增多，對(duì)機(jī)體造成了氧化損傷。HE染色切片發(fā)現(xiàn)20 Gy IR組和30 Gy IR組組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)組織細(xì)胞凋亡、壞死等顯著的病理改變，從組織病理學(xué)角度觀察到高劑量照射對(duì)組織的損傷，較為全面地驗(yàn)證了本次試驗(yàn)建立的動(dòng)物模型。在臨床治療的過(guò)程中，為了減輕患者放療產(chǎn)生的并發(fā)癥，采用分割根治性化療，但由于實(shí)驗(yàn)條件所限，本次實(shí)驗(yàn)采用的是單次大劑量照射；另外在照射的過(guò)程中為了方便動(dòng)物的固定與定位，將動(dòng)物麻醉，這樣不能排除麻醉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，今后實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)研究的過(guò)程中會(huì)盡量模擬實(shí)際臨床治療條件，進(jìn)一步設(shè)計(jì)動(dòng)物的固定方式，避免麻醉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

綜合以上各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果提示在本實(shí)驗(yàn)室的條件下，對(duì)頭部進(jìn)行30 Gy單次照射可以引起大鼠認(rèn)知功能障礙，冀勝軍等[5,10]通過(guò)不同劑量的電子線對(duì)SD大鼠進(jìn)行單次全顱照射發(fā)現(xiàn)，2 Gy和10 Gy全顱照射不足以引起大鼠在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生急性認(rèn)知功能障礙，30 Gy可以成功誘導(dǎo)大鼠發(fā)生急性認(rèn)知功能障礙，與本次研究結(jié)果一致，與其不同的是本次實(shí)驗(yàn)增加了20 Gy IR組，檢測(cè)到部分指標(biāo)提示有放射性損傷，且本次實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)均在照射后30 天檢測(cè)。本次電離輻射致認(rèn)知功能損傷動(dòng)物模型的成功建立為下一步的機(jī)制研究、輻射防護(hù)劑的研究提供了動(dòng)物模型、奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。