和解止痛顆粒對偏頭痛大鼠模型c-fos、c-jun基因表達的影響

成光宇 趙德喜 榮春書 劉立明 李琳 姚金文 顧兆偉 翟超

(1長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021；2吉林省腫瘤醫(yī)院)

偏頭痛主要表現(xiàn)為單側動脈性頭痛，并伴有神經(jīng)癥狀，包括惡心、嘔吐、畏光、畏聲、視覺障礙、認知障礙、情緒和運動干擾等。偏頭痛患病率在女性中為15%～18%，男性為6%～7%，慢性偏頭痛的全球流行率為0.5%～1.0%〔1，2〕。研究表明，偏頭痛的發(fā)病機制與即早基因(IEG)的過度表達有關，IEG是細胞接受刺激后表達的基因〔3〕。c-fos 和c-jun是一對關系密切的IEG，是一種神經(jīng)激活的標記，與痛覺調控密切相關〔4〕。本實驗探討和解止痛顆粒對偏頭痛大鼠模型c-fos、c-jun基因表達的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 健康Wistar大鼠60只，體重150～200 g。由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。主要試劑與儀器：“和解止痛顆粒”(亞泰明星制藥有限公司)；硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，國藥準字H11020289)；水合氯醛注射液(sigma)；兔抗c-fos抗體(abcam)；兔抗c-jun 抗體(abcam)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)濃縮型試劑盒(bioswamp PAB180021)；石蠟切片機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司RM2235)；攤片機(湖北康強醫(yī)療器械有限公司TKD-TK)；IMS圖像分析系統(tǒng)(武漢華聯(lián)科生物技術有限公司DFC295)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及偏頭痛大鼠模型制備 60只健康Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組、治療組各15只(8只雄性，7只雌性)，各組大鼠在同一環(huán)境下喂養(yǎng)7 d，隨后灌胃7 d。第15天，空白組皮下注射生理鹽水，其余各組皮下注射硝酸甘油注射液(10 mg/kg)制備偏頭痛大鼠模型〔5〕。20 min后大鼠表現(xiàn)為耳赤、煩躁不安、前肢頻繁搔頭、攀籠行為次數(shù)增加，30～50 min達到高峰，上述現(xiàn)象持續(xù)2.0～2.5 h，繼而大鼠活動減少，逐漸蜷臥，提示造模成功。

1.2.2實驗給藥 空白組及模型組大鼠均按10 mg/kg的劑量以0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d。陽性藥物組以1.8 mg/kg鹽酸氟桂利嗪灌胃，1次/d。治療組以“和解止痛顆粒”7.6 g加水溶解至150 ml，予10 ml/kg灌胃，1次/d。觀察各組大鼠行為學變化，每0.5 h記錄1次。

1.2.3大鼠組織包埋與固定 大鼠皮下注射硝酸甘油4 h后，10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)麻醉，固定，經(jīng)心臟主動脈插管，剪開右心耳，快速推注0.9%氯化鈉注射液，4%多聚甲醛磷酸緩沖液300 ml灌注，90 min后斷頭取腦組織，置于10%甲醛中固定48 h。用乙醇逐級脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。

1.2.4免疫組化染色 將切片組織置于65℃恒溫烘箱中烤片1 h。切片脫蠟，熱修復抗原，孵育一抗12 h(4℃)，滴加生物素標記的二抗孵育30 min(37℃)，DAB顯色、蘇木素復染3 min、透明、樹膠封片。應用免疫陽性細胞密度〔6,7〕的統(tǒng)計學參數(shù)映射到c-fos和c-jun免疫染色切片，隨機選擇觀察各組免疫陽性細胞數(shù)及光密度值。免疫組化染色陽性反應為陽性表達區(qū)域著色加深，c-fos陽性細胞細胞核染色為棕黃色，c-jun陽性細胞胞質為棕黃色〔8〕。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠耳紅持續(xù)時間比較 空白組在整個過程中始終未出現(xiàn)耳紅，與模型組〔(169.56±5.97)min〕比較，陽性藥物組〔(140.51±9.29)min〕與治療組〔(148.17±8.63)min〕大鼠耳紅持續(xù)時間均明顯縮短(P<0.01)，且治療組較陽性藥物組有所延長(P<0.01)。

2.2各組大鼠搔頭次數(shù)隨時間延長的變化情況 造模前，各組大鼠搔頭次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后，與空白組比較，其余各組搔頭次數(shù)明顯升高(P<0.05)，陽性藥物組與治療組明顯低于模型組(P<0.01)。31～60 min和61～90 min內，陽性藥物組與治療組較模型組顯著減少(P<0.01)，陽性藥物組與治療組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，61～90min內除空白組外各組大鼠搔頭次數(shù)均達到最高值。91～120 min、121～150 min和151～180 min內，除空白組外的各組大鼠搔頭次數(shù)逐漸減少，治療組較陽性藥物組明顯減少(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠攀籠次數(shù)隨時間延長的變化情況 造模前各組大鼠攀籠次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后，與空白組比較，其余各組攀籠次數(shù)明顯升高(P<0.01)，陽性藥物組與治療組較模型組明顯減少(P<0.05)。31～60 min和61～90 min內，陽性藥物組與治療組較模型組顯著減少(P<0.05)，陽性藥物組與治療組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。61～90 min內，除空白組外各組大鼠攀籠次數(shù)均達到最高值，91～120 min和121～150 min內，除空白組外各組大鼠攀籠次數(shù)逐漸減少，陽性藥物組與治療組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。150～180 min內，各組均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠搔頭次數(shù)隨時間延長的變化情況次)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01；與陽性藥物組比較：3)P<0.05；下表同

表2 各組大鼠攀籠次數(shù)隨時間延長的變化情況次)

2.4免疫組化實驗中c-fos、c-jun基因表達情況 空白組可見c-fos、c-jun少量陽性細胞，且光密度值表達不強；與空白組比較，模型組陽性細胞數(shù)顯著增多，光密度值顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥物組與治療組陽性細胞數(shù)、光密度值均明顯減少(P<0.01)，且陽性藥物組較治療組均明顯減少(P<0.01)。見表3，圖1。

表3 各組大鼠腦組織切片c-fos、c-jun陽性細胞數(shù)量及光密度值比較

圖1 各組c-fos、c-jun基因的表達(×200)

3 討 論

c-fos和c-jun是原癌基因，也是IEG，能與基因激酶等信使通路發(fā)生耦聯(lián)，編碼核基因。在正常情況下，c-fos、c-jun基因表達水平很低，但受到傷害性刺激時(如腦缺血、血管性病變、神經(jīng)沖動等)，c-fos、c-jun基因立即被啟動復制并轉錄表達，最終分別轉錄為fos基因和jun基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，硝酸甘油能使偏頭痛大鼠腦切片中c-fos、c-jun的表達升高，從而推測的表達與偏頭痛有一定相關性〔8〕。鹽酸氟桂利嗪是具有循證醫(yī)學證據(jù)支撐、預防性治療偏頭痛的有效藥物〔9〕。c-fos、c-jun的陽性表達可被鹽酸氟桂利嗪抑制〔9〕，故選其為研究藥物的對照藥，如果研究藥物亦能減少c-fos的表達，則提示研究藥物治療偏頭痛起效〔10〕。

偏頭痛致病因素復雜，臨床表現(xiàn)多樣，加之其主要臨床特點與《傷寒論》中少陽病的病機有高度切合性，趙德喜等〔11〕據(jù)此提出“從少陽病論治偏頭痛”的觀點，臨床擅用《傷寒論》中的小柴胡湯加減治療偏頭痛，取得良好療效，并在臨床實踐中不斷總結，逐漸形成了“和解止痛方”，治療偏頭痛患者3 000余例，臨床效果顯著，已制成中藥制劑“和解止痛顆粒”并獲得了發(fā)明專利〔12〕。和解止痛顆粒中包含7味藥：柴胡、川芎、黃芩、姜半夏、黨參、白術、炙甘草。方中柴胡、川芎為君藥。柴胡辛散苦泄，性味微寒，歸肝膽經(jīng)，擅于清半表半里之邪，為和解少陽之要藥。川芎性溫味辛，能祛風止痛，且現(xiàn)代學研究已證實川芎可明顯改善腦供血，優(yōu)化神經(jīng)元新陳代謝等功效。諸藥合用，共奏和解少陽之樞機〔13〕。

本實驗結果表明，和解止痛顆粒可有效縮短大鼠耳紅持續(xù)時間，減少大鼠搔頭及攀籠次數(shù)，并縮短大鼠搔頭、攀籠緩解遷延的時間，從大鼠行為學上證實了和解止痛顆粒起到鎮(zhèn)痛作用。另外“和解止痛顆粒”能夠有效抑制c-fos、c-jun基因的表達，從而減少神經(jīng)元活性，抑制傷害性痛覺的傳遞，緩解疼痛刺激，提高神經(jīng)元的穩(wěn)定性，抑制神經(jīng)元對傷害性刺激的特殊興奮，起到鎮(zhèn)痛作用，縮短頭痛發(fā)作時間，緩解疼痛程度。

綜上，和解止痛顆粒治療偏頭痛有效，c-fos、c-jun基因可能是其鎮(zhèn)痛作用靶點。