CRISPR/Cas9基因編輯系統的發展及其在醫學研究領域的應用

朱佩琪, 蔣偉東, 周 諾*

(1.廣西醫科大學附屬口腔醫院，南寧 530021；2.廣西口腔頜面修復與重建研究自治區級重點實驗室，南寧 530021；3.廣西顱頜面畸形臨床醫學研究中心，南寧 530021；4.頜面外科疾病診治研究重點實驗室(廣西高校重點實驗室)，南寧 530021)

近幾十年來基因編輯技術發展迅速，通過操縱宿主基因組中的功能性DNA序列進行基因組編輯是生物醫學研究的基本策略。RNA干擾(RNA interference，RNAi)和工程DNA結合蛋白技術(鋅指核酸酶 zinc finger nucleases，ZFN或轉錄激活因子樣效應物核酸酶 transcription activator-like effector nucleases，TALEN)是靶向基因調控的強大技術[1]。RNAi是目前遺傳學方法中應用較廣泛，并且具有操作簡單、效果顯著的優點，但該技術具有一定的局限性，不能作用于所有基因和某些細胞類型(如神經元)，還有顯著的脫靶效應、具有毒副作用等缺點。后續發展的第一、第二代人工核酸酶技術即ZFN技術和TALENS在基因編輯效率以及脫靶率上得到明顯改進，但是作為定制的DNA結合蛋白，他們對操作者的專業能力要求高，成本較高[2]。直到2013年初，一種全新的基因組定點改造技術被開發，即為CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated protein 9)，這一技術為在各種生物體中進行基因組編輯打開了使用RNA導向的核酸酶的大門[3]。與其他的基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9具有操作方便、設計簡單、效率高、成本低以及可同時進行多位點編輯等優勢。目前該系統為研究基因功能和生物進展提供更為理想的方法和先進的動物模型，極大的促進了各種疾病在體內條件下的研究。本文綜合論述了CRISPR/Cas9的作用機理、發展歷史及其在醫學領域的應用，為更好地挖掘出CRISPR/Cas9在疾病治療方面的潛力提供參考。

1 CRISPR/Cas系統研究歷史

1987年，Ishino等[4]在研究大腸桿菌中lap酶參與的堿性磷酸酶的同工酶轉化時發現的iap基因，是可以追溯到的關于CRISPR的最早報道。iap基因包含一段十分獨特的29nt重復序列，這些序列以串聯的形式重復出現，并被5個32 nt的非重復序列間隔開。接下來，越來越多的細菌和古細菌基因組被測序并被鑒定出CRISPR序列。大量的數據表明，大約有40%的細菌和90%的古細菌基因組含有這一獨特的序列[5]。直到2002年，這一獨特的重復串聯序列家族正式被命名為CRISPR，取自的它的英文全稱Clustered regularly interspaced short palindromic repeats首字母縮寫[6]。同時，CRISPR系統相關基因(CRISPR-associated genes，Cas)也被鑒定出來[6]，它們具有一定的保守性。據此，研究人員將CRISPR/Cas系統進行了大致分類,確定了CRISPR/Cas系統的三種主要類型，其中Cas3、Cas9(formerlycsn1)和Cas10分別是I型、II型和III型系統的標簽基因。2005年，有研究發現CRISPR序列與細菌的適應性免疫功能相關[7-8]。2007年，丹麥的食品添加劑公司Danisco 的Horvath 等[9]發現CRISPR具有抵抗特定噬菌體針對嗜熱鏈球菌的感染的功能，這是第一個證實CRISPR與適應性免疫相關的實驗數據，也是II型CRISPR系統作為一個適應性免疫系統的實驗證據。由于I型和III型相對復雜，CRISPR功能活性需要多種蛋白質配合進行。而II型CRISPR/Cas系統中涉及到的Cas蛋白最少，通常被認為是最小的CRISPR/Cas系統，僅包括CRISPR重復-間隔序列和3～4個cas基因。其中，Cas9基因是一個大分子量的多結構域蛋白質，能夠獨自起到靶向和裂解侵入DNA的功能。此后的十多年里，諸多研究者把目光投向II型CRISPR/Cas系統。2009年后，CRISPR系統的基本功能和機制逐漸清晰，隨后許多研究小組已開始將自然的CRISPR 系統應用于各種生物技術。自2013年首次將CRISPR/Cas9應用于真核細胞的基因編輯后，這一領域的研究發展十分迅速，目前這一系統已經在人類細胞、猴子、豬、小鼠、斑馬魚、果蠅、酵母、植物、秀麗隱桿線蟲以及細菌等基因工程領域成功使用。CRISPR/Cas系統在各種細胞和生物體中進行基因組編輯的通用性和高效性證明了該系統的在基因改造領域的巨大優勢，使其成為高效、便捷精準的新一代基因編輯工具。本文中，筆者總結了CRISPR發展的簡略時間表(圖1)。

圖1 CRISPR/Cas9系統研究歷史Figure 1 History of CRISPR/Cas9 technology

2 CRISPR/Cas9系統的基因編輯過程

CRISPR/ Cas9介導的基因組編輯依賴于雙鏈DNA斷裂(double strand breaks，DSB)和隨后的細胞DNA修復過程。在內源性CRISPR/ Cas9系統中，首先，由成熟crRNA與反式激活crRNA(tracrRNA)結合形成sgRNA(tracrRNA-crRNA復合物)，該復合物負責將Cas9引導至目標位點。其中，tracrRNA與crRNA部分互補，并參與crRNA成熟過程，而另一部分序列(5’末端約20 nt)與靶向序列堿基互補配對。CRISPR/ Cas9介導的序列特異性切割要求crRNA與靶向序列的堿基互補配對和一段短的原間隔序列相鄰基序(Protospacer adjacent motif，PAM)。與靶位點結合后，與crRNA的互補鏈和非互補鏈分別被Cas9切割，在靶點位置產生DSB(圖2)。該過程中，Cas9 蛋白中 HNH 結構域剪切目標鏈，而Rucv結構域切割非目標鏈。最后，由CRISPR/ Cas9產生的DSB將觸發細胞DNA修復過程，包括非同源末端連接(NHEJ)介導的易錯DNA修復和同源定向修復(HDR)介導的無錯誤DNA修復(圖2)。

其中，NHEJ介導的DNA修復可以快速連接DSB，但在靶位點產生小的插入和缺失突變。這些突變就可以幫助各相關領域研究人員對靶基因或基因組元件進行插入和缺失的編輯。例如，Gratz等[26]通過NHEJ介導的DNA修復，通過CRISPR/ Cas9誘導的DNA切割在果蠅基因組的黃色基因座處產生了移碼突變。DSB也可以啟動HDR介導的DNA修復，這比NHEJ介導的DNA修復更復雜。HDR介導的無錯誤DNA修復需要含有同源性的供體DNA序列作為修復模板。通過共同注射Cas9,兩種指導RNA(gRNA)分別靶向黃色基因座的5’和3’序列以及單鏈寡聚脫氧核苷酸模板，Gratz等人用果蠅基因組中的50nt attP重組位點成功替換了黃色基因座[26]。

為了便于在基因組編輯中應用，研究人員設計了一種精密的gRNA，它是一種含有所有必需crRNA和tracrRNA成分的嵌合RNA[27]。目前已經開發了多種CRISPR/Cas9變體，包括能夠識別20或24 nt的gRNA和位于靶點位置的2～4 nt PAM序列。理論上CRISPR/Cas9可以靶向22～29 nt的特定DNA序列，這在大多數基因組中能夠保證靶點的特異性。然而，最近的研究觀察到CRISPR/Cas9對gRNA和其互補靶序列之間的堿基對錯配具有高度耐受性，導致該系統在應用中存在較高的脫靶效應[27-29]。

與ZFN和TALEN相比，CRISPR/ Cas9有幾個顯著優點。ZFNs和TALENs建立在蛋白質引導的DNA切割的基礎上，這需要復雜和耗時的蛋白質工程，選擇和驗證。相比之下，CRISPR/Cas9只需要一個短的可編程gRNA進行DNA定位，相對便宜且易于設計和生產。通過使用Cas9和幾種不同靶位點gRNA，CRISPR/Cas9能夠在多個獨立位點同時誘導基因組修飾。該技術可以加速產生具有多個基因突變的轉基因動物[27]，并破壞一個或數個基因以研究基因功能。

圖2 CRISPR/Cas9介導的基因組編輯示意圖Figure 2 Mechanism of CRISPR/Cas9

3 CRISPR/Cas9系統在醫學領域的應用

大量的研究證明CRISPR/Cas9系統可以快速方便地在哺乳動物細胞系，動物模型或其他物種中實現基因組編輯[28-35]。因此，CRISPR/Cas9系統被視為基因治療的有希望的候選者。

3.1 CRISPR/Cas9系統應用于抗腫瘤免疫治療

腫瘤發生是由多種基因改變所驅動的，并且總是與復雜的免疫反應有關，其涉及腫瘤細胞的免疫逃避和免疫抑制性腫瘤微環境的產生[36]。隨著諸多免疫檢查點的確定，如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)和程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)，近年來，抗腫瘤免疫治療已經成為備受矚目的防治癌癥的策略之一[37-38]。通過對患者的免疫細胞進行基因編輯抗腫瘤免疫治療無疑是一個富有希望的研究方向。

在腫瘤中已經獲得良好的臨床結果的一種方法是免疫檢查點抑制劑，如阻斷CTLA-4，PD-1及其配體PDL-1。已有大量研究表明CRISPR/Cas9介導的PD-1[39]，PDL-1[40]或CTLA-4[41]基因敲除是打破腫瘤治療中基于T細胞的過繼療法耐受性的有效策略。2016年一篇文獻報道，使用CRISPR/Cas9系統通過滅活PD-1來設計癌癥患者的T細胞的兩項臨床試驗正在進行，分別在美國和中國進行[42]。

此外，CRISPR/Cas9介導的基因組編輯在基因治療中最具前景的應用之一是CAR T細胞的產生。CAR通常含有識別和結合特定腫瘤相關抗原的胞外單鏈可變片段和驅動T細胞活化的細胞內嵌合信號傳導結構域[43]。作為一種新型的基因治療方法，CAR T細胞療法，尤其是CD19特異性CAR T細胞療法在治療B細胞急性淋巴細胞白血病[44]和非霍奇金淋巴瘤[45]中顯示出顯著的抗腫瘤活性。然而，臨床研究中發現這種治療具有體內神經毒性，并可能引起細胞因子釋放綜合征[44-45]。此外，目前進行的CAR T細胞臨床試驗主要是通過收集患者的T細胞，對其進行基因修飾，在將它們送回患者體內，從而達到治療目的。但這種方式對醫療設備和技術人員的技術要求極高，更重要的是，想要從患有嚴重疾病的患者身上獲得足夠功能完整的自體細胞也是十分困難的。這些都極大地限制了這一技術在臨床上的推廣應用。為了克服這些障礙，通過編輯來自一個供體的同種異體T細胞制造出“通用”CAR T細胞，然后施用給多個其他患者，已經成為新的研究方向。研究表明，使用CRISPR-Cas9將CD19特異性CAR靶向T細胞受體α保守(T-cell receptor a constant，TRAC)位點不僅可以在人外周血T細胞中產生均一的CAR表達，還可以增強T細胞的活性，大大優于傳統的在ALL的小鼠模型中產生CAR T細胞[46-47]。然而，同種異體T細胞上的內源性αβ T-細胞受體(αβ T-cell receptor，TCR)可能識別受體中的組織相容性抗原，導致移植物抗宿主病，且同種異體T細胞表面表達人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)往往會觸發宿主快速免疫排斥反應。這成為了利用CRISPR/Cas9系統開發“通用”CAR T細胞的一大挑戰。

雖然仍然存在一些挑戰，但基因編輯和腫瘤免疫治療方面的巨大進步使其成為人類疾病基因治療的有希望的方法。許多科研工作者相信，在提高該方法的安全性并降低脫靶率后，該系統可以迅速應用于臨床腫瘤治療。

3.2 CRISPR/Cas9系統應用于病毒性疾病治療

由于病毒突變率高和潛伏感染，病毒引起的疾病難以治療，尤其是人類宿主中的潛伏病毒幾乎是不可能被消滅的。近年來，基因治療成了治療病毒性疾病的新寵。CRISPR/ Cas系統起源于古細菌和細菌的免疫系統，賦予其對外源遺傳元件如質粒和病毒(噬菌體)的抗性，并為宿主提供獲得性免疫[48-49]。

目前常用的抗病毒藥物的作用機制主要是阻斷病毒復制周期，比如阻斷病毒進入宿主細胞或是阻礙病毒的基因組復制等。但是這一治療的缺陷是只能在病毒進入復制周期時起作用，無法消滅潛伏期病毒。因此，制定出能夠破壞病毒基因組的治療策略，是抗病毒治療領域十分值得研究的方向之一。借助CRISPR/Cas系統對病毒基因組進行編輯，可以達到這一效果。2016年，有研究者設計了針對ICP0的sgRNA，用以治療HSV-1感染[23]，這是一種重要的病毒編碼蛋白，可調節HSV-1病毒基因的表達和復制。同年，Diemen等[24]利用CRISPR/ Cas9技術來抑制皰疹病毒在潛伏感染和裂解感染模型中的復制。這項研究顯示CRISPR系統能夠抑制三種皰疹病毒家族成員：EBV，HSV和HCMV[24]。2018年一項研究報道中描述研究人員設計了RNA引導的CRISPR/ Cas9靶向HIV-1調節基因tat和rev，并選擇了基于六種主要HIV-1亞型的CRISPR特異性和序列保守性的gRNA。然后在持續和潛伏的HIV-1感染的T細胞系中進行了測試，結果顯示CRISPR/Cas9在持續和潛伏感染的人CD4 + T細胞系中能夠成功抑制HIV-1復制[25]。

雖然目前在藥物研發方面已然取得了巨大的成就，現有的治療方案包括小分子藥物(如siRNA)，抗病毒藥物，蛋白酶抑制劑和預防性疫苗。然而對于許多持續性、潛伏期長、高復發性或是高度流行的病毒仍然缺乏有效的治療方案，病毒治療領域仍有許多未被攻克的領域。CRISPR/ Cas9技術的發展為治療潛伏性皰疹病毒感染提供了一種新穎而有前景的策略。盡管這一方案的有效性和安全性仍然需要更多的臨床前研究數據來證明，但不可否認的是，CRISPR/ Cas9仍然有潛力成為針對病毒感染的有效療法。

3.3 CRISPR/Cas9系統應用于遺傳性疾病治療

在完成人類基因組計劃以后，醫學正迅速發展成為基因組醫學學科。盡管目前許多疾病距離基因治療仍十分遙遠，但是在過去25年中，人類對各類疾病發病機制的知識積累，尤其是許多疾病的遺傳基礎的了解達到了指數增長，尤其是許多無法治愈的遺傳性疾病。許多研究者認為，糾正這些疾病相關的點突變同時保留遺傳功能的策略是治療遺傳疾病的理想方法。CRISPR/Cas9技術通過Cas9在突變位點處或附近引入DNA DSBs，然后通過NHRJ或HDR誘導不同類型的插入，導致基因突變，敲入，刪除，反轉等，在這一過程中有機會糾正基因組中相應缺陷，從而達到治療遺傳疾病的效果。

2014年，Yin等[50]報道了一項在成年小鼠體內進行的CRISPR/ Cas9介導的HDR糾正Fah基因點突變的研究，證明了利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯糾正基因突變在成年動物中是可行的，并且具有糾正人類遺傳疾病的潛力。這種策略也被應用于其他類似遺傳疾病的研究，如Yang等[51]利用同樣的技術成功校正了小鼠Otc基因外顯子4的G→A點突變，證實了該療法對新生小鼠高氨血癥的治療效果。此外，HDR介導的點突變校正也已應用于包括β-地中海貧血[52]，慢性肉芽腫病[53]，Duchenne肌肉萎縮癥[54]，鐮狀細胞病[55]和嚴重聯合免疫缺陷[56]。國內在該領域的研究也十分令人矚目，已將CRISPR/ Cas9技術應用于大鼠、小鼠、豬、猴等各類動物模型[57-61]。如可用于Abcb1基因相關藥物代謝研究的Abcb1基因敲除大鼠和人源化大鼠模型[57]，Rag2、IL2rg基因突變的T、B及NK細胞聯合免疫缺陷BABL/c小鼠[58]，用于2型糖尿病研究的Irs1 基因敲除大鼠[59]，用于癌癥研究的基因修飾工具豬模型[60]。此外，在非人類靈長類動物疾病模型[61]的建立上CRISPR/Cas9技術也有巨大的潛力，可以預測CRISPR/Cas9技術能夠使靈長類動物成為各相關領域研究人員研究重大神經系統疾病的發病機制及疾病的早期干預和藥物篩選的重要動物模型。

CRISPR/Cas9技術為靶向基因編輯提供了強有力的工具，并且已經在遺傳疾病的治療發展中展現出其強大的潛力。無論是在體外實驗還是動物實驗中，使用CRISPR/Cas9技術來校正基因缺陷已經取得了顯著進展，使得治療性基因編輯有望應用于臨床。同時，在臨床應用中該技術的使用也需要考慮療效、準確性、安全性以及倫理問題。

4 天使或魔鬼？——風險問題

實際上，“基因療法”并非CRSIPR技術出現后才被提出的概念。早在1990年，美國就批準了人類第一個對遺傳病進行體細胞基因治療的方案，將腺苷脫氨酶基因(ADA)導入兩名患有嚴重復合免疫缺陷綜合征(SCID)的兒童T細胞中[62]。然而，隨著在1999年，一位在賓夕法尼亞大學接受基因治療實驗的18歲患者，在實驗期間出現多器官功能衰竭后死亡，敲響了第一個質詢“基因療法是否安全”的警鐘[63]。此后幾年內，基因療法的臨床試驗一再出現安全問題。最終，基因療法臨床試驗暫停，幾乎不再有人提及。直至2015年，借助TALEN基因編輯技術，倫敦大奧蒙德街醫院一位1歲大女嬰Layla Richards的白血病被“治愈”[64]。不過，這一病例中研究人員只是對健康捐獻者的T細胞某些引起機體免疫排斥反應的基因進行了刪除，以防止這些外來T細胞被病人自身的免疫系統和抗癌藥物的攻擊，從而提升女嬰的免疫能力，爭取更多的治療時間。正如她的主治醫生所說，只是起到了“橋梁”作用，最終想要治愈還是需要進行骨髓移植。然而，全球首例利用基因療法“治愈”的白血病，仍然給科學界帶來了極大的鼓舞。而CRISPR/Cas9技術的發展更是在技術上實現了巨大的突破，似乎基因療法就在眼前。

但是，CRISPR/Cas9技術的風險問題，也不容忽視。今年6月11日，Nature子刊NatureMedicine上同期發表的兩篇在人多能干細胞中進行相關研究發現[65-66]：CRISPR基因編輯造成的DNA雙鏈斷裂會激活p53，引起人多能干細胞的凋亡。而p53是重要的抑癌基因，這意味著最后被“篩選”出來的細胞，極有可能是存在p53功能缺陷的細胞，這就使得患者處于癌癥風險之中。雖然目前尚無直接實驗證實其致癌性，但是這一研究結果再一次為CRISPR/Cas9應用于臨床治療敲響了警鐘。這也再一次提醒了大家，在應用于人體之前，CRISPR還有很長的一段路要走。

5 總結與展望

目前CRISPR/Cas9系統憑借其明顯優勢已經成為基因編輯系統的焦點，且該技術用于靶向基因組編輯和調控的應用正在不斷增長，并擴展到更廣泛的生物體和細胞類型。作為現代科學中革命性的基因組編輯技術，它可以作為工具建立動物模型，糾正缺陷性致病基因，消除病毒/細菌感染，治療癌癥和重新編程神經元細胞。目前，科研工作者們已經能夠成功地利用該技術為研究特定基因的功能建立疾病模型。在器官移植領域、病毒類疾病以及遺傳類疾病方面，該技術也已有了明顯的突破。相信CRISPR/Cas9技術在今后的基礎研究和臨床治療中能夠取得更大的突破，大放異彩。但不可忽視的是，任何基礎研究中獲得的研究成果，想要應用于臨床治療，都還需要大量的研究，既要保證保證安全性，也要保證有效性。