番茄筋腐病抗感材料果實中CAD基因的表達與分析

李芬 王輝 李文麗 王富

摘要：以筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31的果實為材料，研究了番茄果實不同發育時期木質素含量的差異、果實中CAD基因的預測及2個CAD基因的相對表達。結果表明，C285果實中木質素含量在轉色期時達到峰值，紅熟期略有降低，而P31果實中的木質素含量在綠熟期、轉色期及紅熟期變化較小，綠熟期含量最低、紅熟期最高;利用擬南芥CAD基因作為參考基因，在番茄中共查詢到5個CAD旁系同源基因，且在核酸水平與擬南芥中同源基因間的一致性為66.7%;5個CAD基因在2份材料中存在13個突變位點，其中Solyc01g107590（CAD590）和Solyc03g078440（CAD440）突變位點較多;CAD590和CAD440在P31的綠熟期和轉色期相對表達量較為穩定，在紅熟期則大幅升高，而2個基因在C285中則均呈下降趨勢，其中CAD440降幅更大;綠熟期CAD590和CAD440在C285中相對表達量與P31相比分別高出2倍和5倍，轉色期P31中CAD590和CAD440則分別高于C285同期的表達量，其增幅分別為44.4%、130%、170%;而紅熟期2個基因的相對表達量在P31材料中差異較小。因此推斷CAD基因的表達與木質素含量之間存在一定關系。

關鍵詞：番茄;筋腐病;木質素;肉桂醇脫氫酶（CAD）;基因表達與分析

中圖分類號： S436.412.1+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0081-04

隨著人們對于番茄需求量的增加，番茄的栽培面積在不斷擴大，尤其是設施栽培面積逐年增加，但病害也層出不窮，近年來，番茄筋腐病成為嚴重制約番茄生產的一類生理性病害，影響番茄果實的商品價值，成為迫切需要解決的問題。番茄筋腐病，也稱條腐病，一般發生在冬、春季的設施保護地與露地，主要危害果實，但葉片和莖在外觀上并無明顯變化。1921年，這種病害被首次提及，隨后在世界上廣為報道。Bewley等得出番茄筋腐病產生的重要因素是缺鉀[1]。但同時有研究表明僅多施鉀肥不能徹底解決問題。1958年，日本的農學家首次在該國發現番茄筋腐病，隨后發現致病的其中一個關鍵原因是保護地長期連作。該病在果實上表現出褐變型筋腐果與白變型筋腐果2種類型。研究發現引起番茄筋腐病發生的因素包括番茄品種、溫度、光照時間、光照度、CO2含量、土壤理化性質、施肥種類等。

木質素（lignin），是酚類多聚體，植物體內的大分子物質，由肉桂醇單體集聚而成，有運輸水分與礦物質、增強機械強度及抵御不良環境的作用。木質素的生物合成途徑由2步組成：在細胞質中，通過一系列酶催化，苯丙氨酸或酪氨酸逐步轉化為木質素單體，然后被轉運到細胞壁通過脫氫聚合成木質素[2]。肉桂醇脫氫酶（cinamyl alcohol dehydrogenase，簡稱CAD）是木質素合成途徑中最早研究的酶類之一，主要在木質素單體合成過程中的最后一步起作用[3-4]。CAD基因存在同源基因，擬南芥中CAD類似基因有17個，9個基因（AtCAD1～AtCAD9）與煙草和火炬松存在70%相似，為真正CAD基因，余下8個基因（AtCAD101～AtCAD108）為相似基因[5]。大多數植物中，CAD底物類似物被抑制活性后，植物抗病能力減弱，易感染病原菌。

目前，CAD對木質素的合成、調控已取得較好成效，主要在楊樹、水稻、小麥中的改良品種、抗病方面的研究，但CAD基因的表達與分析對番茄筋腐病所產生的影響以及如何指導番茄育種的報道還非常少。因此本試驗以番茄筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31為試驗材料，通過對木質素代謝關鍵基因CAD的分析，研究番茄筋腐病果實與正常果實在相對基因表達量上的差異分析;研究抗感番茄筋腐病果實在綠熟、轉色及紅熟期果實中基因CAD的表達，探討番茄筋腐病發生過程中木質素生物合成與哪些基因的異常表達有關，從而揭示筋腐病發生的分子機制，達到從分子角度進行預防的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用的2份番茄材料為青島農業大學大學園藝學院番茄課題組提供的筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31。

1.2 試驗方法

1.2.1 木質素含量測定方法 本試驗中通過木質素（lignin）含量試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定木質素含量。

1.2.2 CAD基因的預測及突變位點分析 參考擬南芥CAD基因家族的9個基因，從番茄的基因組中去找同源基因。系統進化樹采用Mega 4.0的NJ（neighbor joining）法。直系和旁系同源基因的一致性采用Needle程序（http：//emboss.sourceforge.net/）。突變位點分析主要依據P31和C285這2份材料的重測序數據。

1.2.3 熒光定量分析方法

1.2.3.1 植物總RNA的提取及cDNA的合成 本試驗中通過EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（TaKaRa公司）進行。cDNA的合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。

1.2.3.2 CAD基因引物設計 針對CAD基因在2份材料中的突變位點分析，篩選出2個突變位點較多的同源基因Solyc01g107590（CAD590）和Solyc03g078440（CAD440），采用Primer3軟件進行引物設計，擴增片段長度設定在180～250 bp，引物長度為20 bp左右，退火溫度為60 ℃，所設計的引物如表1所示。內參基因選用Actin，引物信息（F：5′-CAAACGAGAATTGCCTTGGT-3′，R：5′-CTTAACATCCGCACCAACCT-3′），擴增片段長度為233 bp，退火溫度為60 ℃。

1.2.3.3 熒光定量PCR 以番茄果實cDNA為模板，熒光定量PCR儀選用Roche（Light Cycler 480）。反應體系（20.0 μL）：RNA的反轉錄反應液（cDNA溶液）1.6 μL，10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ，0.8 μ正向引物，0.8 μ反向引物，6.8 μL dH2O。反應程序：95 ℃ 30 s;PCR反應40循環（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）;熔解。試驗設置3次重復，反應結束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線。

1.2.3.4 數據處理與分析 采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量;采用Excel 2010和DPS 7.05進行數據處理分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 不同番茄果實發育過程中木質素含量的比較

由圖1可知，番茄感病高代自交系C285果實中木質素含量在轉色期時達到峰值，紅熟期略有降低，而P31果實中的木質素含量在綠熟期、轉色期及紅熟期變化較小，綠熟期含量最低、紅熟期最高。

2.2 番茄中CAD基因的預測

在番茄基因組（SL 3.0）及注釋基因的基礎上，針對擬南芥中CAD家族基因，采用BLASTN和BLASTP程序對番茄中木質素生物合成基因進行了鑒定。筆者在番茄中共搜索到5個同源基因，分布于番茄染色體1、3、11、12等4條染色體中，

番茄CAD基因與擬南芥相應基因間在蛋白質水平上保持 61.5%～73.0%的一致性，平均為66.7%（表2）。

擬南芥中CAD家族成員有9個基因，且功能均已通過驗證，該家族基因也有串聯重復基因簇出現（CAD6、CAD7和CAD8）。通過序列比對發現在番茄中存在5個同源基因，同時也有串聯重復基因簇的出現（Solyc11g011330和Solyc11g011340）。系統進化分析發現（圖2），2個串聯重復基因簇聚在一個分支，這暗示CAD在擬南芥和番茄中可能經歷了相似的進化途徑。Solyc03g078440與CAD9、CAD2及CAD3聚為一簇且與2個串聯重復基因簇親緣關系較近;Solyc12g055820與CAD1聚在一起，兩者可能為直系同源基因;Solyc01g107590則與CAD4和CAD5親緣關系較近。

2.3 不同番茄材料中CAD基因的變異分析

2份材料重測序數據（表3）顯示，5個CAD基因中有13個SNP（單核苷酸多態性）或InDel（插入缺失標記）位點，且絕大多數突變位點分布在基因間區或內含子區。Solyc01g107590和Solyc03g078440在2份材料中存在的變異位點較多，分別為4個和5個，突變位點多有可能在基因表達水平產生影響。

2.4 不同番茄果實中CAD基因的表達

2.4.1 不同番茄果實發育過程中CAD的表達與分析 在果實發育過程中2番茄CAD基因的相對表達量見圖3，CAD590和CAD440在P31的綠熟期、轉色期和紅熟期相對表達量較為穩定;而2個基因的表達在C285中則均呈下降趨勢，其中CAD440降幅更大。

2.4.2 不同番茄果實相同發育階段CAD的表達與分析 木質素生物合成關鍵基因CAD在2份材料中的相對表達結果（圖4）顯示，綠熟期CAD590和CAD440在C285中相對表達量與P31相比分別高出約2倍和5倍;轉色期P31中CAD590和CAD440則分別高于C285同期的表達量，其增幅分別為130%和170%;就紅熟期而言， 2個基因的相對表達量在P31

材料中差異較小。

3 討論與結論

本研究以擬南芥中CAD基因家族的9個基因作為參考基因，在番茄中共查詢到5個CAD旁系同源基因，且在核酸水平與擬南芥中同源基因間的一致性為66.7%;5個CAD基因在2份材料中有13個存在突變位點，其中Solyc01g107590和Solyc03g078440在2份材料中存在的變異位點較多。番茄抗病材料P31和感病材料C285的果實中木質素含量在不同生育階段均有差異，感病材料C285中木質素含量在轉色期時達到峰值，紅熟期略有降低;抗病材料P31中的木質素含量在3個時期變化較小，綠熟期含量最低、紅熟期最高。說明抗病材料P31在番茄生長過程中，CAD基因表達正常，木質素含量相對穩定，而感病材料C285在每個時期其木質素含量不如抗病材料P31穩定，CAD基因存在變異所致，這與已有研究結果[8-9]一致。

本研究結果表明，CAD590和CAD440在P31的綠熟期和轉色期相對表達量較為穩定，在紅熟期則大幅升高;而2個基因的表達在C285中則均呈下降趨勢，其中CAD440降幅更大。綠熟期CAD590和CAD440在感病材料C285中相對表達量與P31相比分別高出2倍和5倍，轉色期也分別提高了130%和170%，而紅熟期2個基因的相對表達量在2份材料中差別較小。同一基因在不同材料中同一時期表達不同，不同基因在同一材料同一時期也不盡相同，這與朱金鑫等的研究結果[10-11]一致。

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收稿日期：2017-10-27

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2014CQ034）;山東省現代農業產業技術體系建設專項（編號：SDAIT-05-02）;青島農業大學高層次人才科研基金（編號：663-1115041）;山東省農業良種工程。

作者簡介：李 芬（1993—），女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向為蔬菜遺傳育種與分子生物學。E-mail：15192642252@163.com。

通信作者：王 富，博士，教授，研究方向為番茄遺傳育種及生物技術。E-mail：wangfuabcd@163.com。