奶牛性別控制試驗的效果驗證

席繼鋒 袁立崗 楊楠 鄧雙義 賈斌 張永生 李超程 夏歡 王香祖

摘要：為滿足畜牧生產需求，更有效地控制奶牛的后代性別，采用RNA干擾技術分別對2頭成年健康繁殖性能正常的荷斯坦公牛Zfy基因mRNA進行干擾，應用SPSS 19.0統計軟件進行卡方檢驗分析方法。結果顯示，與對照組相比，干擾組公牛的后代性別比例發生明顯的偏移，母犢比例達75%以上，而子代的體尺、生長發育及繁殖性能等均無變化。得出結論，干擾Zfy基因生產奶牛性控精液的方法簡單、方便、易操作，在生產中具有一定的推廣價值和應用前景。

關鍵詞：奶牛;性別控制;試驗;效果驗證

中圖分類號： S823.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0195-02

與Y染色體相關的鋅指蛋白轉錄因子（Y chromosome linked Zinc-finger protein transcriptional factor，Zfy），是位于Y染色體短臂上的能夠編碼鋅指蛋白的基因。Zfy基因參與哺乳動物的單倍體生精細胞的更新分化和發育，對于減數分裂和精子生成至關重要。Zfy與精子的形成與發生相關，作為一個較強的轉錄激活因子，引導靶基因穿過核膜，定位于精子細胞核內，可能對精子變態過程中的某些基因具有轉錄激活作用[1-2]。1986年，Vergnaud等通過對Y染色體上有不同缺失的患者的DNA文庫進行分子雜交，首次克隆獲得了Zfy基因[3]。而睪丸決定因子最佳候選基因Sry被發現前，Zfy基因曾被認為是睪丸決定因子的候選基因[4]，在雄性睪丸生長發育過程中發揮重要作用[5-6]。彭強等首次用RNAi的方法通過構建Zfy基因siRNA重組表達載體進行小鼠體內RNAi的研究，從而研究編碼Zfy基因在精子的生成過程中的作用，其后代出現雄性小鼠比例下降現象[7]。馬軍德通過逆轉錄病毒RNAi載體對小鼠進行性別控制產生了顯著效果，在小鼠后代性別鑒定中絕大部分窩組的母鼠率都達到了70%以上[8]。本研究就Zfy基因干擾技術在奶牛性別控制中的應用進行簡單的介紹。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與設備 酵母、蛋白胨、氯化鈉、氨芐青霉素、無內毒素質粒提取試劑盒（北京天根生化有限公司）、無水乙醇、異丙醇、雙抗（上海英駿生物技術有限公司）。

冷凍離心機、水浴鍋、振蕩器、搖床、恒溫干燥箱。

1.1.2 試驗動物 試驗公牛來自新疆天山畜牧生物工程股份有限公司種公牛站，隨機選擇系譜資料完整的健康荷斯坦種公牛2頭，受配荷斯坦母牛均健康、成年，繁殖性能良好。

1.2 方法

1.2.1 重組表達質粒制備 將保存的菌種從-80 ℃超低溫冰箱中取出，室溫解凍后，超凈臺中將200 μL菌液接種至200 mL含氨芐青霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani培養基，搖床內37 ℃、8 000 r/min過夜培養。12～16 h后將處于對數期的菌液取出，按照無內毒素質粒大提試劑盒說明書提取質粒，測定濃度后-20 ℃保存備用。

1.2.2 Zfy基因mRNA表達水平檢測 通過實時定量PCR（RT-PCR）檢測重組干擾質粒pLL3.7-A、pLL3.7-B對奶牛生精細胞的Zfy基因mRNA表達水平的干擾效果，結果顯示，與對照組（未做任何干擾處理）相比，奶牛生精細胞轉染pLL3.7-A后Zfy基因mRNA表達水平顯著降低了50%（P<0.05），轉染質粒pLL3.7-B后Zfy基因mRNA表達水平降低了76%，與對照組差異極顯著（P<0.01）（圖1）。

1.2.3 公牛體內干擾試驗 選取1頭荷斯坦種公牛做對照，不做任何處理。選擇干擾效果較好的質粒pLL3.7-B進行體內試驗。將提取好的質粒用滅菌PBS濾液稀釋，同時加入雙抗以防止感染，然后按每管2.5 mg/5 mL的量對質粒進行分裝。試驗組公牛每側睪丸注射劑量2.5 mg，沿睪丸縱軸進針，一邊注射一邊緩慢回抽針頭，注射完畢拔出針頭，碘酒消毒。試驗公牛間隔7 d注射1次，共注射3次。第3次注射后第7天開始采精，以后每隔7 d采精1次，連續采精5次。收集精液，迅速檢測精子活力和密度，然后制作0.25 mL的細管凍精，液氮中凍存備用。

1.2.4 奶牛配種 奶牛配種均采用人工授精技術，試驗組（注射pLL3.7-B干擾質粒）和對照組分別配種母牛100頭，試驗組與對照組奶牛均在同一條件下飼養管理。

1.3 統計分析

數據采用SPSS 19.0統計軟件進行Fisher（卡方檢驗）檢驗試驗結果的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 奶牛后代性別統計

對照組和試驗組奶牛由專人負責管理，記錄牛號、年齡、胎次、配種日期、產犢日期等，統計結果見表1。

由表1可知，對照組母犢率為51.58%，公母比例接近 1 ∶ 1，與生產實際中的正常性別比例相比差異不顯著（P>0.05）;試驗組母犢率高達75.26%，與生產實際中的正常性別比例相比差異極顯著（P<0.01）。

2.2 奶牛體尺測量

隨機選取試驗公牛和普通公牛后代各5頭進行體尺測量（體高、背高、肩高、十字部高、體斜長、體直長、胸圍、管圍、坐骨端高、腰角寬、頭長、最大額寬、最小額寬、尻長），具體數據見表2。

由表2可知，試驗組奶牛體尺與對照組奶牛體尺對應的各項指標差異不顯著（P>0.05），說明性控奶牛生長發育正常，性控凍精可以進一步在生產中推廣。

3 討論

動物的性別決定機制與眾多基因調控通路和機制相關聯，人們往往通過研究性別決定的關鍵基因來調控動物性別和探究調控機制。Zfy基因曾被確定為性別決定候選基因。目前研究表明，盡管它不能直接決定睪丸的發育和原始生殖嵴的分化，但是它對于單倍體Y精子的發育起到關鍵作用。Y染色體上的特異基因Zfy對于Y精子頭部和尾部的發育[9]、生殖細胞的減數分裂[10-12]、染色體聯會交換的發生及染色體的失活[13]等起著重要的作用。

Zfy基因是位于Y染色體上的特異性基因，是染色體上編碼鋅指蛋白的基因，從減數分裂期開始表達，在圓形精子細胞中的含量最高。Page等明確指出Zfy基因與性別分化、精子發生有關[14]。Zfy基因是Y染色體短臂上特異性單拷貝序列，一直以來人們針對Zfy基因的特異性主要集中在動物性別鑒定方面的研究，而利用該基因進行動物性別控制方面的研究仍為空白，本試驗的開展將對家畜的性別控制技術開發提供新的思路和方法。

參考文獻：

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收稿日期：2018-09-06

基金項目：2017年度新疆農業職業技術學院資助課題（編號：XJNZYKJ201704）;新疆生產建設兵團第十二師科技專項（編號：NYJH2013010）。

作者簡介：席繼鋒（1978—），男，甘肅人，博士，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：fftt2011@163.com。

通信作者：王香祖，博士，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：173897302@qq.com。