靈芝多糖對脂多糖誘導的小鼠乳腺炎的保護作用

苗景 何祥波 許錦聰 林仕欣 梁學武

摘要：靈芝多糖（GLP）是靈芝中主要功能性活性成分，具有增強免疫力、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖和降血脂等功效。采用大腸桿菌內毒素脂多糖（LPS）誘導小鼠乳腺炎，研究靈芝多糖對小鼠乳腺炎的保護作用。試驗選取剛分娩的健康雌性小鼠75只，分為空白對照組、LPS組、LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組，LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8%GLP組分別灌胃2%、4%、8%的靈芝多糖溶液，空白對照組和LPS組灌胃等量的生理鹽水。注射LPS后，測量小鼠體溫變化，24 h后取乳腺制作石蠟組織切片，并測定乳腺中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性。結果表明，與空白對照組相比，LPS組小鼠體溫變化顯著，乳腺組織切片出現明顯的中性細胞浸潤現象，IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性顯著上升;LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8%GLP組與LPS組相比，小鼠體溫變化有顯著改善，18 h后LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組與LPS組差異顯著（P<0.05）;與LPS組相比，LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8%GLP組小鼠乳腺中性細胞浸潤現象明顯減輕，LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組的TNF-α、IL-1β含量顯著低于LPS組（P<0.05）;LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組中IL-6含量顯著低于LPS組（P<0.05），LPS+2% GLP組與LPS組差異不顯著（P>0.05）。上述結果表明，添加4%、8%靈芝多糖可以減輕由LPS引起的小鼠乳腺炎反應。

關鍵詞：小鼠;靈芝多糖;脂多糖;乳腺炎

中圖分類號： S853.74 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0197-04

梁學武，教授，主要從事反芻動物營養與生產研究，E-mail：faulxw2000@163.com。 奶牛乳房炎是奶牛場常見的疾病之一，是奶牛健康養殖中極具挑戰性的難題。乳腺炎是由病原微生物感染、理化因素刺激等引起的一種炎癥反應。其中病原微生物感染是導致乳房炎的主要因素，研究發現，大腸桿菌是引發乳腺炎的主要環境性致病菌。脂多糖（LPS）是大腸桿菌細胞壁外膜主要成分，可通過細胞信號轉導系統激活單核巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞等合成和釋放多種細胞因子和炎性介質，誘導乳腺炎[1-2]。奶牛乳腺炎是生產中普遍存在的問題，可造成巨大的經濟損失。使用奶牛進行試驗成本高，且操作復雜，小鼠具有成本低、操作簡單、重復性好和易于管理等優點，因此國內外常使用小鼠作為乳腺炎研究的動物模型[3-6]。

臨床上多采用抗生素方法治療乳腺炎，但存在細菌產生耐藥性、食品及生態安全風險等諸多弊端，且復發率較高[7]。使用抗生素防治乳腺炎風險逐漸顯現，尋找新的無毒無抗、綠色安全的替代制劑越來越迫切[8]。靈芝多糖（GLP）是靈芝中重要的生物活性成分，具有增強動物機體免疫功能，提高中性粒細胞吞噬和殺菌能力的作用，同時具有降低組織損傷程度的功效[9]。本研究通過灌胃給予小鼠靈芝多糖，對小鼠乳房注射脂多糖建立乳房炎模型，通過分析表觀癥狀和病理學表現及相關免疫因子的表達情況，研究靈芝多糖對小鼠乳腺炎的保護作用，為大腸桿菌性奶牛乳腺炎的預防研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為120只雌性和30只雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質量為18～20 g，購自福建中醫藥研究院。小鼠自由采食和飲水，試驗溫度為24±1 ℃，相對濕度為40%～80%。

1.2 試劑

靈芝多糖購自吾靈（福州）生物科技有限公司，含量為30.1%;LPS（大腸桿菌055：B5）購自西格瑪化學公司。髓過氧化物酶（MPO）活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 小鼠分組及給藥方案

試驗用小鼠適應性飼養1周后，將雄鼠和雌鼠按1 ∶ 4比例合籠飼養，使雌鼠受孕，密切觀察小鼠的生長情況，并在受孕第14天摸胎確認懷孕鼠，納入后期試驗。再選取泌乳為 1～2 d，體表健康，乳區無損傷，質量為40 g左右的初產小鼠75只。將75只小鼠均分為5組，分別為空白對照組、LPS組、LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組、LPS+8% GLP組。LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組分別灌胃 0.4 mL 2%、4%、8%的靈芝多糖溶液，空白對照組和LPS組灌胃等量的生理鹽水。試驗期為17 d。每天08：00灌胃1次，最后1次灌胃1 h后LPS組、LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組注射LPS溶液。注射LPS 24 h后脫頸處死小鼠。

1.4 乳腺炎模型

使用10%水合氯醛對小鼠進行腹腔麻醉，麻醉后，在第4對乳頭及周圍區域用75%乙醇消毒，用無菌手術剪剪除乳頭1 mm左右。使用帶有32 g針頭的微量注射器在第4對乳頭處各注射0.2 mg/mL LPS溶液50 μL。

1.5 樣品采集與處理

注射LPS后，在0、6、12、18、24 h連續測定各組小鼠體溫并記錄。試驗結束后小鼠禁食、不禁水過夜，乙醚吸入麻醉，稱質量，摘眼球采集血液，測定小鼠乳腺MPO活性、TNF-α含量、IL-1β含量和IL-6含量等指標。取小鼠右側乳腺，經4%多聚甲醛溶液固定后，制作石蠟切片，采用顯微鏡觀察并拍照。

1.6 統計學處理

計量資料使用平均值±標準誤差表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 靈芝多糖對小鼠狀態及體溫的影響

如表1所示，在LPS注射6 h后，LPS組小鼠體溫最低，為37.07 ℃，與其他組相比差異顯著（P<0.05），LPS+GLP組小鼠體溫顯著低于空白對照組（P<0.05），LPS+8%組小鼠體溫顯著高于LPS+2%組（P<0.05），與LPS+4%組差異不顯著（P>0.05）;在LPS注射后12 h時，LPS組和LPS+GLP組小鼠體溫上升，LPS組和LPS+2% GLP組小鼠體溫顯著高于其他組（P<0.05），LPS+8% GLP組小鼠體溫顯著高于空白對照組（P<0.05），與GLP+4%組差異不顯著（P>0.05）。在LPS注射18、24 h時，各組之間體溫差異顯著（P<0.05），其中LPS組小鼠體溫最高，分別為39.06、39.43 ℃，空白對照組體溫最低，分別為37.60、37.63 ℃。

2.2 小鼠乳腺組織的變化

如圖1所示，與對照組相比，LPS組的乳腺病理變化最為嚴重，乳腺腺泡中呈現水腫現象，腺泡結構被嚴重破壞。LPS+GLP 組乳腺細胞出現中性粒細胞浸潤，乳腺的病理變化較輕。組織病理學切片結果表明，靈芝多糖在一定程度上可有效緩解LPS誘發的乳腺炎。

2.3 靈芝多糖對LPS刺激小鼠乳腺組織中MPO活性的影響

如表2所示，LPS組乳腺組織中MPO活性顯著高于空白對照組（P<0.05），表明LPS可成功誘導小鼠乳腺炎癥。LPS+2% GLP組、LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組乳腺組織中MPO活性顯著低于LPS組（P<0.05），表明靈芝多糖可以抑制小鼠乳腺組織中MPO的產生。

2.4 靈芝多糖對LPS刺激小鼠乳腺組織中主要炎性因子的影響

如表3所示，與空白對照組相比，LPS組小鼠乳腺組織中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P<0.05），LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組的TNF-α、IL-1β含量顯著低于LPS組（P<0.05）;LPS+4% GLP組和LPS+8% GLP組中 IL-6含量顯著低于LPS組（P<0.05），LPS+2% GLP組IL-6含量與LPS組差異不顯著（P>0.05）。

3 討論與結論

炎癥是機體對各種致炎因子及局部損傷所產生的防御性反應。臨床上，炎癥局部可產生紅、腫、熱、痛及功能障礙，并伴有不同程度的全身反應。發熱是LPS感染的主要反應之一，引起動物發熱的致熱源一般分為2類：一類是由宿主產生和釋放的內源性致熱源，另一類則是由微生物產生的外源性致熱源[10]。研究發現，IL-1β、IL-6和TNF-α都屬于內源性致熱源[11]。注射LPS后， 小鼠出現精神萎靡不振、 反應遲鈍、活動明顯減少的表現，同時乳腺出現紅腫現象，這和Roches等在奶牛上的觀察結果一致[12]。小鼠感染LPS后，體溫呈現出先下降后上升的趨勢，總體在24 h時溫度達到最高值。劉萍等的試驗結果[10-11]與此相同。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁表面主要的毒力因子，是引起大腸桿菌性乳腺炎的主要原因。當LPS進入乳腺組織中時，會引起大量的中性細胞聚集。中性粒細胞的生理作用直接消滅突破了第1道免疫屏障的入侵抗原，當中性粒細胞檢測到抗原或接收到來自組織細胞的信號時，便會大量流入組織[13]。進入乳腺組織中的中性粒細胞在吞噬抗原的同時，也會導致部分乳腺細胞結構出現一定程度的萎縮，甚至遭到破壞[14]。Merriman等研究發現，在乳腺炎發病期間，嗜中性粒細胞幾乎占了總體細胞的90%[15]。本試驗中，LPS組乳腺組織出現明顯的水腫和中性粒細胞浸潤現象。

LPS通過Toll樣受體4（TLR4）傳遞信號，經過信號轉導的方式進一步激活下游的炎癥信號通路NF-κB和MAPKs，產生炎癥因子、黏附分子、趨化因子、生長因子和環氧化酶等炎癥介質，引發全身炎癥反應[16-17]。IL-1β是白細胞介素家族的重要成員之一，可通過誘導機體釋放大量炎性細胞因子來引起炎癥瀑布反應[18]。TNF-α是一種高度促炎性的細胞因子，可促進內皮細胞的活化以及白細胞向感染部位的募集和活化。據報道，使用大腸桿菌感染乳腺可大大增加血液和牛奶中的TNF-α含量[19]。IL-6由2型輔助（Th2）細胞分泌，可參與先天性和獲得性免疫各個方面的調節。Alhussien等使用大腸桿菌刺激乳腺，結果發現，IL-6表達量顯著增加[19]。研究發現，使用LPS刺激小鼠，可使機體中的IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞炎性因子含量急劇增加[20-21]。在本研究中，LPS組小鼠體溫變化明顯，乳腺腺泡中呈現水腫和明顯的中性細胞浸潤現象，與空白對照組相比，乳腺中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量和MPO活性呈顯著增加，表明LPS成功誘導小鼠乳腺產生炎癥反應。

靈芝多糖（GLP）是靈芝中主要生物活性成分，具有抗菌、增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖和降血脂等功效[22-23]。Skalicka-Wo z′niak等研究發現，靈芝多糖具有抑菌能力，對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉菌和黑根霉菌具有較高的抑制能力[24-25]。GLP對先天性和適應性免疫應答具有很強的免疫調節能力。GLP能夠顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A和IL-4的分泌，緩解由葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘發的結腸炎，維持腸道的穩態[26]。余鈺驄等研究發現，靈芝結構多糖水解單體GLSP1和GLSP2可以抑制LPS誘導的巨噬細胞增殖，減弱其吞噬功能，并下調LPS激活的巨噬細胞產生的NO和TNF-α的水平[27]。江國勇等在丙烯酰胺小鼠模型中，使用黑靈芝多糖灌胃小鼠，結果發現，黑靈芝多糖可顯著降低小鼠肝臟中的IL-1β和IL-10水平，改善丙烯酰胺造成的肝臟損傷[28]。在本研究中，靈芝多糖通過抑制乳腺組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的產生，顯示出抗炎作用。病理組織學切片觀察結果表明，靈芝多糖可減輕大腸桿菌內毒素引起的病理損傷。此外，在靈芝多糖濃度為2%、4%和8%時，乳腺中的MPO活性水平顯著降低。這些結果表明，靈芝多糖可緩解由大腸桿菌感染引起的乳腺炎癥反應。