一種油菜組織高通量研磨技術及其在甘藍型油菜鎘吸收研究上的應用

萬何平 陳倫林 錢佳麗 沈金雄 傅廷棟

摘要：鎘（Cd）是對人類有毒害作用的重金屬，同時也是對植物最具危害性的重金屬元素之一。利用油菜水培技術對300份不同來源的甘藍型油菜進行苗期鎘脅迫處理，并對300份甘藍型油菜幼苗地上、地下組織中的Cd含量進行測定。結果顯示，在5 mg/L Cd濃度脅迫下，300份材料的地上部分Cd濃度平均值為244.78 μg/g，最小值為 142.44 μg/g，最大值為430.00 μg/g;地下部分Cd濃度平均值為1 816.16 μg/g，最小值為743.07 μg/g，最大值為 3 323.30 μg/g;植株Cd總吸收量的平均值為299.14 μg，最小值為107.27 μg，最大值為817.30 μg。其中，13個材料的Cd吸收總量低于150 μg，屬于Cd低積累材料，43份材料的Cd吸收總量高于400 μg，屬于Cd高富集材料。此外，為了提升油菜組織Cd含量測定效率，對油菜干樣研磨技術進行了改進，與傳統研磨方法相比，該試驗方法的研磨效率提升了50倍，大幅提升了樣品研磨的通量和效率。

關鍵詞：甘藍型油菜;鎘吸收;高通量研磨技術

中圖分類號： S634.301 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0208-04

目前，我國面臨著十分嚴峻的土壤鎘（Cd）污染問題。據不完全統計，我國每年約有1 200萬t糧食被鎘污染，因土壤鎘污染導致的糧食減產超過1 000萬t，直接經濟損失達200億元以上[1]。日益加劇的耕地重金屬污染問題嚴重威脅著世界農業發展和人類食品安全。有學者提出通過特殊的超累積植物提取土壤中的重金屬，從而達到修復土壤的目的。近年來，該技術已發展成為一種經濟有效并具有廣闊應用前景的植物修復技術[2]。

甘藍型油菜是用來取籽榨油的一類十字花科作物，是世界上分布最廣、種植歷史悠久、最重要的油料作物之一，其產量僅次于棕櫚油[3]。在我國，油菜是第一大油料作物，無論是其種植面積還是產量均位居油料作物首位，近年來，油菜的種植面積穩定在670萬hm2左右，年產油量約為450萬t，我國城鄉居民消費的食用植物油脂中近60%是油菜提供的[4-5]。根據植物體內鎘的積累量，可以把植物分為低積累型（如豆科）、中等積累型（如禾本科）和高積累型（如十字花科）3種類型[6]。研究結果顯示，十字花科蕓薹屬的油菜具有較強的吸收和富集Cd的能力，且不同油菜品種對Cd的吸收和富集能力存在較大差異[7]。通過種植低吸收、低積累鎘的油菜品種來達到降低植株體內Cd含量的目的，生產符合食品安全標準的農產品具有實際應用價值。與此同時，通過種植高吸收、高積累Cd的油菜品種可以達到修復鎘污染土壤的目的[8]。目前，關于油菜Cd吸收和積累的相關研究僅有少量報道，如向丹等對篩選出的高吸鎘能力、低吸鎘能力油菜品種進行全生育期土培盆栽試驗，研究2個油菜品種各器官吸收累積鎘的特征及體內鎘的分配差異，結果顯示，2個油菜品種地上部吸收的鎘主要累積在莖、葉中，各器官中的鎘含量在2個品種中均表現為葉>莖>角果殼>籽粒[7]。牛雅典研究了不同油菜品種在不同生長期對鎘的吸收、遷移和累積特征，結果顯示，苗期芥菜型油菜品種地上部鎘含量低于甘藍型油菜品種;在臺期和成熟期，芥菜型油菜品種的地上部鎘含量則逐漸高于甘藍型油菜品種，且鎘在不同油菜品種體內分布的一般特征為莖葉>根>角果殼>種子[9]。然而，關于大規模鑒定油菜Cd吸收和積累能力的研究還未見相關報道。

開展作物Cd吸收積累相關性狀的研究，首先是要對大批量植物組織樣品內的Cd含量進行系統精確的測定。目前植物中Cd的測定方法主要有比色法、火焰原子吸收光譜法、無火焰原子吸收光譜法和原子熒光法[10]，利用這些測定方法前需要對植物組織樣品進行烘干處理并將其研磨成粉末。目前，研究人員常用的研磨植物組織干樣的方法主要有研缽研磨、植物組織粉碎機研磨等，此類研磨方法十分低效，且存在樣品之間相互污染的風險，因此，樣品的研磨效率已成為高通量測定植物組織Cd含量的限速步驟。

甘藍型油菜已經發展成為集油用、菜用、飼用、綠肥和觀花于一體的多功能作物，選育低積累或超富集的油菜品種對農業生產均有重要價值。本研究開發了一種油菜組織干樣的高通量研磨技術，利用該技術對300份甘藍型油菜苗期的Cd吸收和積累能力進行鑒定，探究鎘脅迫下不同甘藍型油菜品種對Cd的吸收和分配規律，以期為進一步選擇和應用Cd高積累的油菜進行土壤修復提供種質材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料為國家油菜產業技術體系收集的300份來自世界主要油菜種植國家的甘藍型油菜種質材料，其中絕大部分材料來自我國各油菜育種單位。

1.2 油菜苗的培養與脅迫

為了減小環境對試驗結果的影響，本試驗采用水培方法評價幼苗期鎘積累的相關性狀。本試驗于華中農業大學國家油菜改良中心武漢分中心的油菜溫室內進行2次表型鑒定，溫室條件：溫度（20±2） ℃，光照—黑暗周期16 h—8 h，光照度2 500 lx。

具體操作步驟如下：（1）苗床的準備。用尼龍線將長×寬×高為60 cm×40 cm×12 cm的盆分割成96格，并在盆的表面鋪上1層無菌紗布作為苗床。

（2）播種。向苗床內加滿純水，以保證整片紗布浸濕，將甘藍型油菜種子均勻撒播到相應的小格中并記下編號，每個品種播30粒種子。

（3）培養盆和培養板。為了防止綠藻孳生，選用藍色的長×寬×高為60 cm×40 cm×12 cm的盆。將5 mm厚的黑色廣告板制成60 cm×40 cm規格的培養板，用打孔器在培養板上均勻打出77（7×11）個直徑為1 cm的小孔。選用厚度為1 cm的海綿剪成1.2 cm2的方塊，并將海綿方塊沿1條對角線剪開2/3用來固定幼苗。

（4）營養液的配制。幼苗培養所用營養液的配制參照Hoagland營養液配方并稍作修改[11]，全營養液具體配方如下：0.5 mmol/L NH4H2PO4、3 mmol/L KNO3、2 mmol/L Ca（NO3）2、1 mmol/L MgSO4、0.09 mmol/L Na2EDTA、0.09 mmol/L FeSO4、22.5 μmol/L H3BO3、10 μmol/L MnSO4、0.10 μmol/L （NH4）6Mo7O24、0.35 μmol/L ZnCl2、0.20 μmol/L CuSO4。

（5）移苗和營養管理。播種7 d后，待子葉完全展開且下胚軸伸長時，從苗床上選取均勻一致的幼苗，用海綿方塊夾住下胚軸基部，然后移植至培養板上的小孔中并注上標簽，每個材料移植5株幼苗，每株幼苗種植在不同的盆中，每株代表1個生物學重復。最后將固定有幼苗的培養板放置在裝有10 L 1/4全營養液的培養盆中進行水培。3 d后換成1/2濃度的營養液，4 d后更換為全濃度營養液，此后每周都使用全營養液進行培養。注意保證每株幼苗的地下部分浸入水中。

（6）鎘脅迫處理。前人研究結果顯示，在5 mg/L鎘處理下，大部分材料的側根數和主根長度出現嚴重的受害現象[12]。因此，本研究以5 mg/L Cd濃度的營養液對油菜苗進行重金屬鎘脅迫處理。在全濃度培養液中生長1周后進行Cd脅迫，其間每周更換1次營養液。油菜幼苗經鎘脅迫處理3周后收獲幼苗植株。

1.3 油菜干樣的研磨

油菜幼苗經鎘脅迫后，以子葉節為分界點，分別收獲地上部、地下部材料。依次用超純水清洗2次，每次10 min;地下部需用20 mmol/L CaCl2（pH值=5.0）洗脫液溶液清洗2遍，每次15 min，用超純水沖洗干凈，其后于100 ℃殺青2 h，于 80 ℃ 烘干72 h至恒質量。

為了比較幾種方法的研磨效率，筆者分別使用4種方法[研缽、植物組織粉碎機、豆漿機和高速振蕩器（F & FM Australia的型號SK450）]研磨油菜地上部分、根系組織干樣。其中高速振蕩儀的操作如下：將油菜組織干樣裝入50 mL離心管內，裝入2～3個直徑為8 mm的鋼珠后，使用高速振蕩器振蕩5 min，然后用100目篩進行篩濾。

1.4 油菜干樣粉末的消化

精確稱取20 mg左右的樣品，置于14 mL離心管中，加入2 mL 70%硝酸（分析純），輕輕晃動，使所有材料被浸泡，振蕩過夜，在沸水中煮1 h，視消化狀況重復1～2次，冷卻至室溫，補充超純水至總體積為12 mL，混勻后密封待測。利用火焰原子吸收分光光度計（北京瑞利120A），使用標準曲線法測量樣品中的Cd含量。油菜樣品Cd的分析過程采用國家標準參比物質GBW07603（灌木枝葉成分分析標準物質）進行質量控制。

Cd濃度的計算：通過標準曲線計算各樣品的Cd濃度C，然后根據下列公式計算地上部分和地下部分的Cd濃度：

Cd濃度（干質量）（μg/g）=（C×V）/m。式中：C是根據標準曲線得到的濃度，μg/mL;V是定容體積，L;m是消化樣品質量，g。整株Cd吸收總量（TC）=地上部分Cd吸收量+地下部分Cd吸收量。其計算公式如下：

TC=SCC×SDW+RCC×RDW。

式中：SCC為地上部分Cd濃度;RCC為地下部分Cd濃度;SDW為地上部分干質量;RDW為地下部分干質量。

1.5 數據分析

采用SPSS 18.0軟件（IBM Corp，Armonk，NY，USA）對測定性狀的表型值進行基本統計分析。統計內容包括計算表型性狀的最大值、最小值、平均值、標準差和變異系數等。

2 結果與分析

2.1 4種研磨油菜組織干樣方法的效率

比較了高速振蕩儀與3種常規研磨方法的效率，由表1可以看出，研缽研磨樣品的速率為5個/（h·人）;植物粉碎機、豆漿機研磨樣品的速率分別為10、15個/（h·人），較研缽方法而言效率提升了1～2倍，而使用高速振蕩儀方法時，研磨速率為500個/（h·人），研磨效率提升了近100倍，從而實現了油菜組織干樣的高通量研磨。此外，將用4種方法研磨后的粉末用100目篩進行篩濾，表1結果顯示，經3種常規方法研磨后的樣品粉末均需要篩濾，而用高速振蕩儀粉碎后的粉末不需要篩濾。

2.2 鎘積累性狀的遺傳變異

本試驗在溫室條件下對300份甘藍型油菜株系進行了幼苗期Cd積累相關性狀的鑒定，在Cd2+濃度為5 mg/L的水培體系中脅迫3周后，測定地上部分Cd濃度、地下部分Cd濃度以及Cd吸收總量。表2、圖1結果顯示，3個性狀在300份甘藍型油菜材料中存在廣泛的遺傳變異。其中，SCC在300份材料中的平均值為244.78 μg/g，最小值為142.44 μg/g，最大值為430.00 μg/g，變異系數為19%;RCC在300份材料中的平均值為1 816.16 μg/g，最小值為743.07 μg/g，最大值為3 323.30 μg/g，變異系數達到25.68%;TC在300份材料中的平均值為299.14 μg，最小值為107.27 μg，最大值為 817.30 μg，變異系數為18.06%。此外，SCC和RCC的相關系數僅有0.064，沒有達到顯著水平，說明油菜地上部分和地下部分在Cd吸收上無相關性。

從圖2可以看出，3個性狀的分布均呈現出連續的正態或者近似正態分布，說明這3個性狀均符合多基因型控制的數量性狀特征。

2.3 Cd低/高富集油菜的篩選

根據地上部分Cd濃度、地下部分Cd濃度以及植株幼苗Cd總吸收量，對300份甘藍型油菜進行篩選。如表3所示，在300份材料中，有45份材料的地上部分Cd濃度低于 200 μg/g，40份材料的SCC超過了300 μg/g;對于地下部分Cd濃度而言，有36份材料低于1 300 μg/g，35份材料高于 2 400 μg/g;13份材料的Cd吸收總量低于150 μg，屬于低富集材料，例如浙油18、皖油15號和中油821等，有43份材料的Cd總吸收量高于400 μg，屬于Cd高富集材料，其中包含中雙11、中雙10號和淮油12等。

3 討論與結論

超積累植物這一概念最早是由Brooks等在1977年最早提出來的[13]。目前，關于植物對某種或某些化學元素的富集或超富集能力尚無統一的標準[12]。植物中的鎘含量通常低于3 mg/kg，但生長在富鎘土壤上的植物體內含鎘量會大于20 mg/kg[14]。一般認為，植物地上部分鎘含量低于3 μg/g的為鎘富集能力弱的植物，鎘含量在3～10 μg/g之間的為鎘富集能力中等的植物，鎘含量在10～20 μg/g之間的為鎘富集能力較強的植物，鎘含量大于20 μg/g的為鎘富集植物，當植物葉片或地上部（干質量）中的Cd含量達到100 μg/g時，被認為是超積累植物。自Baker等發現能富集Cd含量高達 2 130 μg/g（干質量）的十字花科植物天藍遏藍菜（Thlaspi caerulescens）以來，越來越多的鎘超積累植物被國內外科學家先后發現，且大部分屬于草本植物[15]。然而，由于草本植物植株生物量小、生長周期長且有較強的地域性，并不適合大面積農田污染的修復。因此，研究人員將研究重心轉移到了生物量大，且更具有應用前景的農作物修復上。研究表明，甘藍型油菜的生物量大，且具有較強的吸收和富集Cd的能力[7]。因此，Cd超富集的油菜品種可作為一種修復鎘污染土壤的理想材料。綜合來看，作為食用如菜用、油用和飼用的油菜，應該盡量降低植株中的鎘含量;作為生物柴油用或觀花油菜用，可篩選超富集鎘的油菜品種，應用于鎘污染耕地的修復。

在影響作物吸收Cd的諸多因素中，除了外在的環境因素外，品種間的差異是最主要的因素。研究表明，不同水稻品種由于基因型的不同，而造成植物生理特性、形態結構的差異，使植株對重金屬元素的吸收和分配不同[16-17]。吳啟堂等對20多個品種水稻吸收積累Cd的研究發現，品種間積累Cd的差異可達1倍以上[18]。在本研究中，不同油菜品種Cd吸收量最大差距達到8倍，顯示出更大的遺傳變異，說明甘藍型油菜在鎘吸收性狀上存在非常大的遺傳變異，這種巨大變異也為后期篩選Cd超富集油菜提供了遺傳基礎。此外，同一植物的不同部位在Cd積累量方面也存在很大差異。一般情況下，大多數植物吸收的Cd主要積累在根系，而地上部各組織中的Cd含量一般較低[19]。本研究結果顯示，在甘藍型油菜植株體內，根系中的Cd含量平均為1 816.16 μg/g，而地上部分Cd含量僅為244.78 μg/g，說明油菜根系組織能忍受更高濃度的Cd。近來的研究結果顯示，Cd在根系中主要分布在質外體或形成磷酸鹽、碳酸鹽沉淀，或與細胞壁結合，且植物積累Cd的機制主要通過與細胞壁的結合、與有機化合物形成金屬螯合物及區域化分布等途徑，從而進行解毒[19-20]。

前人研究結果顯示，在10 mg/L鎘脅迫甘藍型油菜水培處理中，地上部分鎘含量高值為246.45 μg/g，低值為 112.2 μg/g，地下部分最高、最低含量分別為1 388.55、655.90 μg/g[9]。本研究結果顯示，地上部分Cd含量在300份材料中的平均值為244.78 μg/g，最小值為142.44 μg/g，最大值為430.00 μg/g;地下部分Cd含量在300份材料中的平均值為1 816.16 μg/g，最小值為743.07 μg/g，最大值為3 323.30 μg/g。與前人研究結果相比，本研究測定的含量高于前人結果，且含量范圍更廣。推測其可能原因，主要是由于本研究測定的油菜材料數量更多，來源更廣，且鎘脅迫處理的時間更長。

植物組織干樣研磨處理是進行各種金屬離子含量測定的前期準備過程。目前，研究人員常用的研磨方法主要有研缽研磨、植物組織粉碎機研磨等。但此類方法十分低效，且存在樣品之間相互污染的風險。為了提升油菜組織干樣的研磨效率，本研究利用高速振蕩儀對油菜根系、地上部分組織干樣進行研磨。結果顯示，利用該方法研磨樣品的速率可達 500個/（h·人），研磨效率較傳統方法提升了近50倍，極大提升了研磨效率。此外，本方法將每個樣品單獨放在1個 50 mL 離心管內，徹底杜絕了不同樣品磨樣過程中可能存在的串樣風險，極大地提升了檢測結果的精確性。本方法不僅限于對油菜組織Cd含量的檢測，同樣適用于大批量檢測水稻、玉米等農作物Cd含量。

本研究開發了1套油菜組織干樣高通量研磨技術，與其他常用研磨技術相比，本技術的研磨效率提升了近50倍。本研究利用水培技術、高通量干樣研磨技術對300份甘藍型油菜種質鎘吸收和富集能力進行鑒定與分級，最終獲得13份Cd低富集材料和43份Cd高富集材料，為進一步利用油菜來修復、開發和利用鎘污染土地提供了重要的種質資源材料。

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收稿日期：2018-11-13

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2016YFD0101300）。

作者簡介：萬何平（1988—），男，湖北武漢人，博士，講師，主要從事油菜非生物脅迫抗性研究。E-mail：362057164@qq.com。

通信作者：陳倫林，博士，研究員，主要從事油菜遺傳育種研究。E-mail：lunlinchen@163.com。