湖羊精液稀釋液及冷凍保護劑的篩選

曹訪 郭良勇 殷雨洋 蔣永清 李玉峰 王衛(wèi)星

摘要：試驗旨在研究不同稀釋液對湖羊精液的4 ℃保存效果，同時探討不同種類及濃度的冷凍保護劑對湖羊精液冷凍保存效果的影響。選擇6種常見的綿羊精液稀釋液配方，檢測湖羊精液稀釋后精子活力變化，分析精子存活時間及生存指數(shù);另選取6種常見的精子冷凍保護劑，分3組濃度（5%、10%、15%）添加，檢測細管凍精解凍后的精子活率。結果表明，6種稀釋液對湖羊精液的4 ℃保存效果存在顯著差異，其中F稀釋液保存效果最佳。冷凍保護劑的種類和添加比例對湖羊精液的冷凍保存效果都存在影響，稀釋液中添加5%的丙三醇對湖羊精液的冷凍保存效果最佳。

關鍵詞：湖羊;精液;精子活力;稀釋液;冷凍保護劑;篩選

中圖分類號： S826.3+4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0201-03

湖羊是我國南方地區(qū)特有的國家級畜禽資源保護綿羊品種，主要分布于江浙滬一帶的太湖流域，具有獨特的波浪形羔皮、多羔、生長速度快等諸多優(yōu)良性能。目前，在綿羊品種改良、選育過程中，人工授精技術因為種公羊利用率高、母羊便于集中管理、可加快選育進程等優(yōu)點，在繁殖領域逐漸受到推崇。相關配套技術諸如優(yōu)秀稀釋液的開發(fā)及冷凍保護劑的研究，也因為可進一步發(fā)揮種公羊的利用潛能、實現(xiàn)遺傳資源保護等原因而受到研究人員的關注。韓天龍等研究表明，4 ℃ 條件下好的稀釋液可使羊精子在較長的時間內保持60%以上的活率[1]。滿都拉發(fā)現(xiàn)，在合理稀釋倍數(shù)下采用優(yōu)秀稀釋液稀釋輸精不影響羊的受精率[2]。朱志偉等則證實了冷凍精液用于保存動物資源的可行性，研究證明添加抗冷凍保護劑丙三醇可使凍精解凍后保持較好的活力[3]。

近年來，綿羊精液的稀釋及冷凍保存技術得到了長足的發(fā)展，如精液稀釋液的開發(fā)以及冷凍保存技術的研究[4]，但單獨針對太湖地區(qū)湖羊的研究與應用較少，并且綿羊精液的低溫稀釋保存效果及抗冷凍保存技術尚存在進一步改善的空間。本研究擬采用不同稀釋液配方對湖羊精液開展稀釋，對精液稀釋保存效果進行比較，以篩選出適合湖羊精液的最佳稀釋液。同時，在此稀釋液基礎上，研究不同冷凍保護劑及添加濃度對湖羊精液冷凍保存效果的影響，以篩選出適合湖羊精液冷凍保存的最佳冷凍保護劑，從而進一步挖掘優(yōu)秀湖羊種公羊的利用潛能，并為當?shù)氐暮蚬┓N及保種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選用長興昌達羊業(yè)有限公司所提供的3只優(yōu)秀種公羊，年齡為2～3歲，試驗選用種公羊膘情為中上等，體質健壯，按常規(guī)進行飼養(yǎng)管理。

1.2 配方

1.2.1 稀釋液配方 試驗選擇了6種稀釋液配方，標記為配方A、B、C、D、E和F，詳見表1。按試驗需要和稀釋液配方中的比例稱取表1中各物質，溶于蒸餾水中，用濾紙過濾，于110 ℃高壓10 min，取出靜置至室溫備用。取新鮮潔凈雞蛋，小心敲除外殼，去掉蛋清，把包有完整卵黃膜的卵黃放在潔凈平皿內，用無菌的去針頭注射器刺破卵黃膜，緩慢抽取卵黃，加入到上述溶液中。將配制好的稀釋液置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 冷凍保護液配方 選擇4 ℃條件下保存效果最好的稀釋液作為基礎液，選擇6種常見的冷凍保護劑，按照試驗要求添加到基礎液中，溶解后制成冷凍保護液，置于4 ℃冰箱中備用。冷凍保護劑添加比例見表2。

1.3 精液處理

1.3.1 精液稀釋保存 采集湖羊精液，經活力檢測及品質鑒定后，等量分裝于滅菌的試驗管內，在35 ℃等溫條件下按照稀釋程序要求，加入預溫的6種稀釋液，分2次等比例稀釋至4倍，細管灌裝后，用紗布包裹細管并裝入離心管，將離心管置于盛35 ℃溫水的大燒杯內，然后將燒杯迅速置于4 ℃冰箱，緩緩降溫至4 ℃保存。每隔24 h鏡檢精子活率，鏡檢時操作溫度控制在35 ℃左右。

1.3.2 精液冷凍保存 采集湖羊精液，在35 ℃恒溫條件下，按照試驗要求采用添加冷凍保護劑的稀釋液將精液分2次等比例稀釋至4倍體積，然后將稀釋好的精液放入4 ℃冰箱緩緩降溫，1.5 h后在4 ℃條件下分裝至凍存管并平衡2 h，然后按照凍存程序將精液凍存。按照試驗安排，依照解凍程序將細管凍精解凍，檢測精子活率。

1.4 流式細胞儀檢測精子活率

解凍后的精子，按照說明用Live/Dead sperm viability Kit（L-7011）（Sigma）試劑盒進行染色，然后用流式細胞儀進行檢測（BD FACSCanto Ⅱ）。

1.5 效果判定

精子活率為直線運動的精子數(shù)占視野中總精子數(shù)的百分比;精子存活時間為99%的精子死亡的存活時間;精子有效存活時間是指精子活率不低于0.5的保存時間;精子生存指數(shù)是指相鄰2次精子活率的平均數(shù)與間隔時間乘積的總和。

2 結果與分析

2.1 稀釋液對湖羊精液4 ℃稀釋保存效果的影響

2.1.1 6種稀釋液對精子活率的影響 由圖1可知，在4 ℃保存條件下，6種稀釋液中的湖羊精子活率隨時間增加而逐漸降低，保存效果存在明顯差異。A、B、C、D 4種稀釋液保存效果較差，A稀釋液中精子活率在1 d后顯著下降;B、C、D稀釋液中精子活率在3 d后顯著下降;E、F稀釋液中的精子保存效果比較理想，2種稀釋液中精子活率在6 d內都能保持在0.6以上;6 d后， E稀釋液中的精子活率降低速度要顯著快于

F，而F整體保存效果要好于E。

2.1.2 不同稀釋液中羊精子的存活時間及存活指數(shù) 由表3可知，在4 ℃保存條件下，6種稀釋液中的精子總存活時間、有效存活時間和生存指數(shù)存在差異，F(xiàn)稀釋液中精子的總存活時間和有效存活時間顯著或極顯著高于其他5種稀釋液（P<0.05或P<0.01），且生存指數(shù)也極顯著高于其稀釋液（P<0.01），F(xiàn)稀釋液對精子4 ℃保存效果最好。

2.2 冷凍保護劑對湖羊精液冷凍保存效果的影響

2.2.1 不同種類及添加比例冷凍保護劑對湖羊冷凍精液精子活率的影響 由表4可知，將細管凍精解凍后，通過鏡檢初步檢測解凍后0 h精子活率，結果表明不同冷凍保護劑對精子的冷凍保存效果存在差異，以乙二醇及丙三醇的冷凍保存效果最佳，湖羊凍精解凍活率保持在0.5左右，且不同濃度的冷凍保護劑對精子的冷凍保存效果也不同，甲醇、二甲基亞砜、乙二醇乙醚的添加濃度以10%為最佳，乙二醇、丙三醇、1，2-丙二醇以5%為最佳。

2.2.2 流式細胞儀活率檢測 通過常規(guī)活率檢測，發(fā)現(xiàn)5%乙二醇和5%丙三醇對精子的冷凍保存效果較好。由圖2可知，通過流式細胞儀對5%乙二醇和5%丙三醇的冷凍保存效果做進一步驗證，發(fā)現(xiàn)精子解凍活率要略高于5%乙二醇，這與前期的鏡檢結果基本一致。所以丙三醇為本試驗的最佳冷凍保護劑，5%為最佳添加濃度。

3 討論

本研究對比了6種稀釋液對湖羊精子的4 ℃保存效果，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)稀釋液的保存效果最佳，在6 d仍可保持60%以上的精子存活率，說明F稀釋液為湖羊精子提供了較好的營養(yǎng)及緩沖。遲慶德等曾利用優(yōu)秀稀釋液對綿羊精液進行稀釋輸精，取得非常理想的情期受胎率[5-7]，本項目組在后續(xù)的研究中也將會開展輸精試驗，并進一步優(yōu)化稀釋液配方，為湖羊的鮮精保存及異地輸精提供保障。

本研究對比了6種滲透性抗冷凍保護劑對湖羊精子的冷凍保護效果，結果發(fā)現(xiàn)乙二醇和丙三醇的保護效果較好，且丙三醇更佳，這與劉玉峰等的研究結果[8]基本一致。相關研究發(fā)現(xiàn)，丙三醇低溫冷凍保護性能，可能與丙三醇能濃縮或結合細胞內水，并具有阻礙冰晶核形成和增長的性能及制菌作用有關;而乙二醇的低溫冷凍保護性能則可能是由于乙二醇分子量小，滲入或滲出細胞的速率與水分子差異不大，對精細胞的滲透壓影響較小[9]。同時，本研究還對6種冷凍保護劑的3種添加濃度進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)，不同冷凍保護劑的最佳添加濃度不一致，如乙二醇甲醚、甲醇的添加濃度以10%為最佳，而丙三醇、乙二醇的添加比例以5%最佳，這可能是因為不同冷凍保護劑對精子的活力和受精力普通存在毒害作用，如甘油能引起精子頂體的異常，而乙二醇則可以引起尾部畸形[10]，冷凍保護劑添加比例過高或過低對精子的毒害作用更顯著。

另外，本研究采用常規(guī)鏡檢和流式細胞儀檢測2種方法，對5%丙三醇和5%乙二醇的冷凍保存效果進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，2種方法檢測出的凍精解凍活率存在差異。這可能與常規(guī)鏡檢存在誤差有關，部分尾部畸形或頂體損傷的精子通過常規(guī)檢測無法判斷，計數(shù)時被統(tǒng)計為正常精子，而流式細胞儀是通過對染色后精子的熒光情況進行篩選，相比較而言數(shù)據(jù)結果更為可靠。4 結論

本研究在比較了6種常用精液稀釋液的基礎上，篩選出更適合湖羊精液稀釋的F稀釋液（果糖、Tris和檸檬酸組合）;并以F稀釋液為基礎，比較了6種冷凍保護劑的3種濃度對湖羊精子凍存的影響，結果發(fā)現(xiàn)，以5%的丙三醇作為冷凍保護劑的效果最佳，凍精活率達到了39.5%，可用于生產實踐，為后續(xù)凍精在湖羊生產中的推廣應用打下了基礎。

參考文獻：

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收稿日期：2018-09-05

基金項目：浙江省農業(yè)重大技術協(xié)同推廣計劃（編號：2019XTTGSG02）;浙江省湖州市農業(yè)新品種選育及產業(yè)化開發(fā)專項主動設計項目（編號：2015ZD2014）;浙江省農業(yè)科學院地方科技合作項目（編號：181022）。

作者簡介：曹 訪（1980—），男，江蘇豐縣人，碩士，高級實驗師，研究方向為動物遺傳育種。E-mail：hzyzucf@hotmail.com。

通信作者：郭良勇，碩士，畜牧師，研究方向為動物遺傳育種。E-mail：1728893756@qq.com。