紅曲菌發酵黃精渣生產monacolin K的探索性研究

陳小林，南海珍，徐志南

(1.杭州德潤全健康產業發展有限公司，浙江 杭州 311500；2.浙江大學化工與生物工程學院生物工程研究所，浙江 杭州 310027)

黃精是我國常用的中藥材，為百合科黃精屬多年生草本植物根莖的總稱，全球有60 余種，主要分布于北溫帶和北亞熱帶，我國有31種，黃精含有多種化學成分，主要包括多糖、甾體皂苷、三萜、生物堿、木脂素、黃酮、植物甾醇及揮發油等，其中多糖和甾體皂苷類成分在黃精中含量較大，為其主要藥效成分[1]。有關黃精的記載始見于《名醫別錄》，其性味甘、平，歸脾、肺、腎經，黃精在降血糖和免疫調節、抗腫瘤、提高學習和記憶能力以及預防心腦血管疾病等方面均有不錯的效果[2-3]。目前黃精的應用主要通過蒸煮炮制后，獲得黃精提取物后,作為中藥飲片應用于臨床或者中成藥的生產。提取后的黃精渣一般都做丟棄處理，這在一方面帶來了環境問題，另一方面對黃精資源也是一大浪費。

紅曲屬物種是非致病性真菌，紅曲菌發酵能產生多種具有生理活性的次生代謝產物，主要有紅曲色素、monacolin K、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)[4]。許多研究表明有些紅曲霉屬的次生代謝物在改善高脂血癥、高血壓、高血糖、阿爾茨海默病發展有一定的作用[5]。Monacolin K 最早是于1979 年由日本學者遠騰章教授在紅曲菌中發現的[6]。Monacolin K也稱為洛伐他汀，是紅曲霉生物活性代謝產物之一，洛伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑，能降低血清甘油三酯和總膽固醇，因此monacolin K已被廣泛用作降低血液膽固醇的有效藥物，是美國暢銷的藥物之一[7]。Monacolin K還可以抑制人類惡性膠質瘤細胞生長，降低小鼠肺癌細胞的轉移[8]。Monacolin K結構式見圖1。

圖1 monacolin K的結構式

許多的研究發現，固態發酵(SSF)有一些生物技術上的優點，例如更高的發酵生產力，更高的產物終濃度和較低的分解代謝抑制[9]。對于SSF中的monacolin K生產，最常用的底物是水稻，一些其他底物，如大豆、花生、甘蔗渣、小米、馬鈴薯可以用于monacolin K生產[10-11]。本研究以黃精渣為底物中的一種用來發酵生產monacolin K，研究物料含水量、黃精渣加入量、米粉加入量、黃豆粉加入量、發酵時間等因素對monacolin K產量的影響，以提高產量，避免黃精渣的丟棄所產生的環境問題，降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 紫色紅曲菌(Monascuspurpureus325)：杭州桐君堂生物科技有限公司；黃精(浙江桐君堂藥業有限公司)；洛伐他汀(Lovastatin，中國食品藥品檢定研究院)；大米、黃豆、麩皮為市售。

紅曲菌液態培養基：葡萄糖4%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%。

1.2 儀器與設備 高效液相色譜儀(德國Waters 2695)，檢測器為Waters 2996；分析天平(Mettler Toledo Ax205)；HZQ-F280全溫振蕩培養箱(太倉市華美生化儀器廠)；SPX-250B-Z生化培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；GR-B2074FNA冰箱(泰州樂金電子冷機有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 Monacolin K的檢測方法 取樣品粉碎過篩，精密稱量，加入50%乙醇提取，搖勻，超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出后冷卻，用50%乙醇補足到刻度，取濾液用有機膜過濾即得待測液。對照品溶液：取lovastatin適量，精密稱量，用乙腈配成每毫升含有40 μg的溶液。即得。

流動相：乙腈∶甲醇∶0.1%磷酸溶液=55∶5∶40；檢測波長為238 nm；流速 1 mL·min-1； 進樣量10 μL。

1.3.2 固態發酵方法 見圖2所示。

圖2 黃精渣固體發酵生產monacolin K流程簡圖

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對紅曲菌發酵黃精渣產monacolin K的影響 取黃精渣300 g，拌入米粉150 g，黃豆粉150 g，攪拌均勻，使其含水量達到40%。隨后裝入發酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液態中20 mL，在22、25、28、31 ℃下發酵15 d，倒出物料，干燥后測定其中的monacolin K含量。試驗結果如圖3所示。

圖3 發酵溫度對monacolin K產量的影響

由圖3中趨勢可知，隨著溫度的升高，monacolin K的產量先增后降，22 ℃～25 ℃時，隨著溫度升高，monacolin K產量不斷提高，在25 ℃達峰值5.45 mg·g-1，隨后溫度升高，產量下降，因此在25 ℃條件下發酵相對來說比較合適。

2.2 黃精渣含量對紅曲菌產monacolin K的影響 分別稱取黃精渣500、600、700、800、900 g，分別拌入米粉和黃豆粉為1∶1的混合粉500、400、300、200、100 g，使黃精渣含量分別為50%、60%、70%、80%、90%；攪拌均勻，控制其含水量為40%。隨后裝入發酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液40 mL，在25 ℃下發酵15 d后倒出物料，物料干燥后測定其中的monacolin K含量。試驗結果如圖4所示。

圖4 黃精渣含量對monacolin K產量的影響

從圖4可看出，隨著黃精渣含量的變化，monacolin K的產量先增后降，當黃精渣含量分別在60%和70%時，monacolin K的含量分別為5.865和5.832 9 mg·g-1，產量相差不明顯，但是黃精渣含量在60%左右時，monacolin K的含量的標準偏差較大，因此在黃精渣含量對紅曲菌產monacolin K的影響試驗中，選取黃精渣含量為70%時較為合適。

2.3 含水量對紅曲菌發酵黃精渣產monacolin K的影響 取黃精渣700 g，拌入米粉150 g，黃豆粉150 g，攪拌均勻，調節其含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%。隨后裝入發酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液40 mL，在25 ℃下發酵15 d，倒出物料，干燥后測定其中的monacolin K含量。試驗結果如圖5所示。

圖5 含水量對monacolin K產量的影響

由圖5可知，monacolin K產量隨著含水量的增加，呈現先增后降的趨勢，在含水量為35%時候，monacolin K產量達到峰值6.51 mg·g-1，但是數據的標準偏差相對較大，操作過程中存在一定的試驗誤差，同時35%的含水量的條件下物料稍顯干硬。有學者發現物料因干燥而松散，不利于菌體的生長[12]，當含水量為40%時，monacolin K產量相對較好可達到4.85 mg·g-1，此時物料不黏連成塊且不顯干燥,發酵過程平穩,有利于菌體生長。當含水量為50%時，發酵的底物結塊嚴重，monacolin K產量低。綜上可知雖然40%的含水量條件下發酵得到的monacolin K產量的標準偏差比35%含水量的數值稍低，但是在綜合考慮試驗誤差、菌體生長以及產物產量的情況下，選取當含水量為40%較為合適。

2.4 黃豆粉與米粉配比對紅曲菌發酵黃精渣產monacolin K的影響 控制黃精渣的含量為70%(取黃精渣700 g，其余300 g)，按照黃豆粉：米粉比例為1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,2∶1加入，調節其含水量為40%，隨后裝入發酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液40 mL，在25 ℃下發酵15 d，倒出物料，物料干燥后測定其中的monacolin K含量。試驗結果如圖6所示。

圖6 黃豆粉與米粉配比對monacolin K產量的影響

由圖6可知，monacolin K的產量隨著米粉的增加呈現出先增后降的趨勢，當黃豆粉與米粉的比例為1∶2時，monacolin K的產量可以達到峰值5.29 mg·g-1，但是它的標準偏差相對較大，當黃豆粉與米粉比例達到1∶1時，monacolin K的產量達到4.05 mg·g-1。在本試驗之前因為不確定最佳配比，所以試驗操作中一直采用黃豆粉與米粉配比為1∶1的比例來進行試驗，綜合考慮成本與monacolin K產量的因素后，選取黃豆粉與米粉的配比為1∶1進行后續試驗。

2.5 發酵時間對紅曲菌發酵黃精渣產monacolin K的影響 取黃精渣700 g，拌入米粉150 g，黃豆粉150 g，攪拌均勻，使其含水量達到40%。裝入發酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液態中40 mL，在25 ℃條件下分別發酵5、10、15、20、25、30 d，倒出物料，干燥后測定其中的monacolin K含量。試驗結果如圖7所示。

圖7 發酵時間對monacolin K產量的影響

由圖7可知，隨著發酵時間的增加，monacolin K的產量也一直增加，發酵前15 d基本呈現線性增加，發酵第15天時，monacolin K產量可達到5.95 mg·g-1；在15～30 d之間，monacolin K大量產生，當發酵30 d后，monacolin K含量可達到16.21 mg·g-1，紅曲霉利用黃精渣進行固態發酵30 d較為合適。

3 結論

通過研究發酵溫度、黃精加入量、含水率、米粉和黃豆粉的配比和發酵時間對monacolin K產量的影響，結果表明當含水量為40%、黃精加入量為70%，米粉與黃豆粉加入量為1∶1，在25 ℃下發酵30 d，monacolin K的產量可以達到16.21 mg·g-1。這一工作表明，紅曲霉能夠很好利用黃精渣進行固

態發酵，并產生較高的monacolin K，這一研發工作對黃精產業深加工和開發下游的黃精系列產品都具有重要的指導意義。