HPLC同時測定茵梔黃顆粒中4種黃酮類成分

劉金宇，李艷芳,2，范建偉,2，劉武占,2

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006)

茵梔黃顆粒是由茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味中藥提取物制成的常用中成藥制劑，經“6912”注射液沿革而來[1]；具清熱解毒，利濕退黃之功效，用于肝膽濕熱所致的黃疸，癥見面目悉黃、胸脅脹痛、惡心嘔吐、小便黃赤，急、慢性肝炎見上述證候者[2]；臨床上對新生兒生理性和病理性黃疸具有比較好的療效[3-5]。

黃芩提取物具有抗菌抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝利膽、抗癌等藥理作用，現代研究表明黃芩提取物的主要藥效物質是其中含有的黃芩苷、野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分[6-9]?！吨袊幍洹?015年版中黃芩提取物是茵梔黃顆粒處方的主要組成部分(占60.25%)，因此僅僅控制黃芩苷的含量難以保證黃芩提取物及制劑的質量。本課題組前期曾對茵梔黃顆粒中環烯醚萜苷類成分同時測定[10]，為進一步深入研究茵梔黃顆粒的質量標準，嚴格控制其質量，本次實驗采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定茵梔黃顆粒中4種黃酮類成分野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量。

1 儀器與材料

安捷倫1100高效液相色譜儀，美國安捷倫公司，OpenLAB CDS工作站；AG285型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司，KQ-250DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。對照品野黃芩苷(批號：110842-200403)、黃芩苷(批號：110715-200514)、漢黃芩苷(批號：112002-201702)、黃芩素(批號：111595-200905)購自中國食品藥品檢定研究院，均為含量測定用；對照品漢黃芩素(批號：MUST-14110311)購自成都曼斯特生物科技有限公司(質量分數≥98%)。茵梔黃顆粒由魯南厚普制藥有限公司提供(批號：00917229、00917230、00917231、00917232、00917233、00917234，3 g/袋)；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇和磷酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～15 min，5%～6%A；15～23 min，6%～10%A；23～42 min，10%～20%A；42～60 min，20%～25%A；60～90 min，25%～60%A；)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：274 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.2 對照品溶液制備 取野黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品、黃芩素對照品、漢黃芩素對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成各對照品儲備液。精密量取各儲備液適量，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得含野黃芩苷34.98 mg·L-1、漢黃芩苷53.19 mg·L-1、黃芩素70.92 mg·L-1、漢黃芩素9.6 mg·L-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取茵梔黃顆粒，研細，精密稱取1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 50%甲醇，密塞，稱定重量，超聲30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱定重量，50%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按茵梔黃顆粒處方比例及制備工藝制備缺黃芩提取物的陰性樣品，按“2.3”項下方法操作，即得。

2.5 系統適用性 分別取上述3種溶液，在“2.1”項下色譜條件依法測定，色譜圖見圖1。由圖可知，各待測成分色譜峰分離度均大于1.5；陰性樣品色譜中，在與野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素相對應的保留時間處無干擾。

1.野黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素圖1 HPLC色譜圖

2.6 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下對照品溶液2、4、6、8、10 μL，按“2.1”項下色譜條件依次測定，記錄峰面積。以峰面積Y為縱坐標，進樣量X為橫坐標進行回歸，經計算得線性回歸方程、相關系數r及線性范圍。

結果分別為：野黃芩苷Y=5×106X-24 467，r=1.000，線性范圍0.070 0～0.349 8 μg；漢黃芩苷Y=1×107X-17 371，r=1.000，線性范圍0.106 4～0.531 9 μg；黃芩素Y=1×107X-140 218，r=0.999 9，線性范圍0.141 8～0.709 2 μg；漢黃芩素Y=1×107X-11 383，r=0.999 9，線性范圍0.019 2～0.096 0 μg。

2.7 精密度試驗 取上述對照品溶液，按上述色譜條件，連續進樣6次，結果各待測組分峰面積RSD分別為野黃芩苷0.55%、漢黃芩苷0.44%、黃芩素0.89%和漢黃芩素0.75%，顯示儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取茵梔黃顆粒(批號：00917234)，按 “2.3”項下方法制備一份供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、16、24 h，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。結果各待測組分峰面積的RSD分別為野黃芩苷0.98%、漢黃芩苷1.41%、黃芩素1.33%和漢黃芩素1.22%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 重復性試驗 取茵梔黃顆粒(批號：00917234)，按 “2.3”項下方法制備6份供試品溶液，按上述液相色譜條件測定分析。測得平均含有量為野黃芩苷0.548 2 mg·g-1、漢黃芩苷0.756 5 mg·g-1、黃芩素1.482 mg·g-1、漢黃芩素0.179 0 mg·g-1，RSD分別為1.00%、0.65%、1.12%、1.36%，表明方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取已知含有量的茵梔黃顆粒(批號：00917234)，研細，精密稱取6份，每份0.5 g，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品儲備溶液適量，按本試驗供試品溶液制備及測定方法進行分析，具體結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.11 樣品含有量測定 取6批茵梔黃顆粒適量，按本試驗方法制備供試品溶液，并測定分析。具體結果見表2。

表2 含有量測定結果(n=3，mg·g-1)

3 討論

《中國藥典》2015年版規定茵梔黃顆粒(3 g/袋)含有黃芩苷180～220 mg[2]，即60.0～73.3 mg·g-1，本課題組前期研究發現野黃芩苷等4種成分總和僅在3.0 mg·g-1左右，說明黃芩苷與野黃芩苷等4種成分含有量差異較大，在同一條件下同時檢測黃芩苷與野黃芩苷等4種成分的含有量，會產生較大的誤差。因此本試驗建立HPLC法同時測定茵梔黃顆粒中4種黃酮類成分野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含有量，未將黃芩苷同時測定。測定結果顯示各待測成分含有量批次間差異較小，4種成分含有量總和在2.868～2.949 mg·g-1范圍內，比較穩定，可用于進一步控制茵梔黃顆粒的質量。

以野黃芩苷等4種成分為指標，考察了超聲、水浴提取兩種提取方法，結果兩種提取方法提取效率相差較小，最終選用了較方便的超聲提取方法。另外經查閱文獻黃酮類成分檢測波長為280[11]、278[12]、275[13-14]、274 nm[15-16]等，本試驗采用DAD檢測器對樣品全波長掃描，發現在274 nm下，野黃芩苷峰前面的干擾峰降至最低，對其含量測定無影響；其他3個成分亦均有較大吸收，且分離度均大于1.5，因此選取274 nm作為吸收波長。