祛風舒筋丸對佐劑關節炎大鼠免疫調節及血管內皮生長因子、細胞黏附分子-1表達的影響

張瑤，屠瑩，胡占嵩，陳麗娟

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis， RA)為自身免疫性疾病，全世界發病率約0.5%～1%，我國發病率約0.4%，女性的發病率高于男性[1-2]。該病以關節滑膜慢性炎癥以及軟骨和骨的破壞為其主要特點[3]，可導致關節畸形和功能喪失，影響病人的生活質量。類風濕性關節炎屬于中醫理論中“痹癥”范疇，發病初期因風寒濕邪侵入經絡關節，導致氣血不通，故為風寒濕痹型，以祛風散寒，利濕宣痹等功效中藥施治[4]。祛風舒筋丸目前收載于2015版《中國藥典》[5]，該藥由防風、牛膝、秦艽、威靈仙等十八味中藥制成，有祛風散寒，除濕活絡之功效，用于治療風寒濕閉阻所致的關節疼痛、屈伸不利、四肢麻木等癥狀。目前對祛風舒筋丸研究多為質量標準的建立[6]，對其抗類風濕性關節炎的作用機制研究鮮有報道。大鼠弗氏完全佐劑性關節炎模型的發病機制和特征與臨床上的類風濕性關節炎較為接近[7]，本研究自2016年10月至2017年3月通過佐劑性關節炎大鼠模型，探究祛風舒筋丸對模型大鼠的免疫調節作用以及對血管內皮生長因子(VEGF)與細胞黏附分子-1(ICAM-1)表達的影響，為該藥用于類風濕性關節炎的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物雄性健康SD大鼠，體質量(250±20)g，清潔級動物，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號 SCXK-(京)-2016-0011。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學標準。

1.2藥物及試劑祛風舒筋丸(北京寶樹堂科技藥業有限公司，規格60 g/100丸)；弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)；白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司，0.3 g/粒)；刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、噻唑藍(MTT)(美國Sigma公司)；RPMI1640培養粉(美國Gibco公司)；多聚甲醛、二甲基亞砜(天津光復化學試劑有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(天津百特醫療用品有限公司)；風濕因子(RF)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(南京建成科技有限公司)；VEGF、ICAM-1免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

試劑配制：將生理鹽水和弗氏完全佐劑在臨用配制前充分搖勻。取適量生理鹽水與弗氏完全佐劑經雙注射器充分乳化1 h(經三通接口反復抽推乳化成油包水乳劑)，配置成 10 mL 的弗氏完全佐劑生理鹽水乳劑。

1.3實驗儀器超凈工作臺(天津艾克瑞特實驗室設備有限公司)；細胞培養箱(美國 Thermo Electron 公司)；酶標儀(美國BIOTEK公司)；小型臺式冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠佐劑性關節炎模型的建立 取雄性健康SD大鼠，體質量(250±20) g，自由飲食、飲水，適應性飼養1周后開始實驗。在進行酒精常規消毒左足趾和尾根部后，用微量注射器于每只大鼠左后足足趾皮下注射 0.1 mL 的弗氏完全佐劑生理鹽水乳劑，尾根部多點皮內注射上述乳劑 0.1 mL 致炎，空白組(隨機取10只大鼠)用同樣方法于其相應部位注射 0.2 mL 生理鹽水。分別于初次造模第6天和第12天后注射乳劑0.2 mL以加強免疫炎癥反應，建立大鼠佐劑性關節炎模型。造模后第12天，按照關節紅腫程度進行關節炎指數(Arthritic Index， AI)的評分[8](評分標準：0分，無關節紅腫；1分，關節發紅而不腫脹；2分，關節輕度紅腫；3分，關節中度紅腫；4分，關節重度紅腫，不能負重。AI=四肢關節評分之和。各組評分>4分認為造模成功，AI<4分的大鼠從實驗組中剔除)。將造模成功的大鼠采用隨機數字表法分為5組，即模型組、白芍總苷膠囊組、祛風舒筋丸低、中、高劑量組，每組10只，共計50只。在造模后的第12天分別測量并記錄左后足趾厚度后，灌胃給藥。白芍總苷膠囊組給藥劑量為0.27 g/kg，祛風舒筋丸低、中、高劑量組(2.16、10.8、21.6 g/kg，相當于臨床等效劑量的1、5、10 倍)，每只大鼠灌胃2 mL，空白組和模型組給予等量生理鹽水，共給藥18 d。

1.4.2祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠關節腫脹度的影響 在造模前及給藥治療前后觀察各組大鼠活動狀態變化及關節紅腫情況，于造模前、造模后第12天、造模后第17天、造模后第21天、造模后第25天、造模后第29天用游標卡尺測量左后足趾厚度，比較治療后各組足趾腫脹程度的變化。計算：腫脹度=造模后足趾厚度-造模前足趾厚度。

1.4.3祛風舒筋丸對大鼠脾淋巴細胞增殖的影響 實驗第30天，即給藥18 d后眼球放血處死大鼠，無菌取脾，制備脾細胞懸液，常規制備單個脾細胞懸液，活細胞大于95%，調整細胞濃度為1×107個/mL，加入96 孔培養板，每孔加細胞懸液100 μL，再加入含Con A 或LPS的RPMI-1640液100 μL(Con A的終濃度為5 mg/L，LPS的終濃度為10 mg/L)，在37℃，5% CO2的培養箱中培養48 h，每孔滴加MTT(5 mg/mL)20 μL后繼續培養4 h，去上清液后滴加二甲基亞砜200 μL，于酶標儀570 nm 處比色測定吸光度值。

1.4.4大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的檢測 實驗第30天眼球放血處死大鼠，將全血以3 000轉/分鐘離心，取血清，-20 ℃保存，按照ELISA試劑盒說明書方法測量血清RF、IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量。

1.4.5大鼠滑膜組織VEGF及ICAM-1蛋白表達的檢測 實驗第30天，即給藥18 d后處死大鼠，仰位固定，酒精消毒處理，去皮毛及肌腱組織，打開膝關節腔可見滑膜組織，將其剝離并放入4%多聚甲醛中固定2 h，經梯度酒精逐級脫水，石蠟包埋，按VEGF及ICAM-1免疫組化試劑盒的具體步驟操作。

2 結果

2.1祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠關節腫脹度的影響各實驗組于弗氏完全佐劑三次致炎造模后第12天給藥，致炎造模后，各組大鼠足趾均明顯腫脹。造模后第12、17天祛風舒筋丸高、中劑量組的足趾厚度均與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05)。造模后第21、25、29天祛風舒筋丸高、中劑量組的足趾厚度均與模型組相比差異有統計學意義(P<0.01)，低劑量組的足趾厚度與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05)，且高劑量組顯示了持續穩定的足趾腫脹抑制作用，效果與白芍總苷組接近，結果見表1。

2.2祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠脾淋巴細胞增殖的影響本研究分別采用Con A誘導的大鼠T淋巴細胞增殖和LPS誘導的B淋巴細胞增殖實驗來評價祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠脾淋巴細胞增殖的影響和對免疫功能的調節作用。模型組吸光度與空白組相比差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，祛風舒筋丸高劑量組和白芍總苷組分別對Con A和LPS誘導的T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖能力有抑制作用，差異有統計學意義(P<0.01)，且與白芍總苷組接近；中、低劑量組對淋巴細胞增殖能力亦有一定的抑制作用，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表2。

表1 祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠關節腫脹度的影響

注：整體分析為兩因素重復測量方差分析。兩兩組間比較為LSD-t檢驗，與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01

表2 祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖的影響

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01

2.3大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α含量的檢測研究證實RF 以其高敏感性作為臨床上類風濕關節炎的損傷程度及病情預后判斷的重要指標[9]。IL-1β、IL-6及TNF-α等細胞炎性因子的表達失衡是RA發病的重要因素[10-11]。實驗結果顯示與模型組比較，祛風舒筋丸高劑量組和白芍總苷組能極顯著降低佐劑性關節炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量(P<0.01)，祛風舒筋丸中、低劑量組能顯著降低佐劑性關節炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量(P<0.05)，且呈現出明顯的劑量依賴性，結果見表3。

2.4大鼠滑膜組織VEGF和ICAM-1表達的檢測

本研究采用免疫組化檢測大鼠關節滑膜組織中VEGF與ICAM-1的蛋白表達，實驗結果顯示與模型組比較，祛風舒筋丸高劑量組和白芍總苷組能極顯著降低佐劑性關節炎大鼠滑膜組織VEGF與ICAM-1蛋白的表達(P<0.01)，中、低劑量組能顯著降低VEGF與ICAM-1蛋白的表達(P<0.05)，且對表達的抑制作用呈現出明顯的劑量依賴性，結果見表4。

表3 祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的影響

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01

表4 祛風舒筋丸對佐劑性關節炎大鼠滑膜組織VEGF和ICAM-1表達的影響

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

RA以關節滑膜慢性炎癥為主要表現，病灶中的滑膜細胞持續釋放細胞因子，造成增生異常并導致病變[12]。本研究中在造模后期(第21～29天)，祛風舒筋丸的中、高劑量組大鼠足跖腫脹均有所減輕，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，高劑量組的效果與白芍總苷組接近，該實驗結果符合該動物模型的特點，證實祛風舒筋丸可以相對延緩類風濕關節炎病人癥狀的后期進展，在提高生活質量方面有著積極的作用。

淋巴細胞轉化實驗是是采用體外刺激物(Con A等)刺激淋巴細胞，使其體積增大，蛋白與核酸合成增加并轉化為具有分裂能力的淋巴母細胞。淋巴細胞轉化率可用來判斷藥物對機體的細胞免疫調節作用[13]。RA作為一種自身免疫性疾病，始于致病抗原被T細胞所識別和激活，繼而引發T細胞增殖和B細胞的活化增殖，導致滑膜新生血管形成，產生細胞因子[14]。實驗研究顯示祛風舒筋丸可以顯著抑制佐劑性關節炎大鼠Con A誘導的T淋巴細胞增殖和LPS誘導的B淋巴細胞增殖，且作用有劑量依賴性，說明祛風舒筋丸可通過抑制T淋巴和B淋巴細胞增殖從而抑制模型大鼠的細胞免疫功能。

RA屬于血管增生性疾病，其基本病理變化為滑膜炎和血管翳的形成，其中包括多種細胞因子、抗原抗體及粘附分子參與[19]。VEGF為目前已知作用最強，特異性最高的血管生長因子[20]，可以特異性地促進血管內皮細胞增殖與遷移，促進血管翳的形成。ICAM-1可導致滑膜細胞的移行增生，在細胞激活過程中提供輔助刺激因子，使白細胞停滯在炎癥局部[21]。因此關節滑膜組織中VEGF與ICAM-1的表達水平可以反映炎癥的變化程度。研究發現祛風舒筋丸高、中、低劑量組均能顯著降低VEGF與ICAM-1蛋白的表達，且對表達的抑制作用呈現出明顯的劑量依賴性，推測該藥可能通過抑制VEGF和ICAM-1的表達，從而阻斷滑膜血管新生和血管翳形成，阻止巨噬細胞和淋巴細胞向局部移行，抑制關節滑膜慢性炎癥的產生。

綜上所述，祛風舒筋丸抗類風濕關節炎作用機制可能與抑制T淋巴和B淋巴細胞增殖調節細胞免疫，抑制IL-1β、IL-6及TNF-α等細胞因子生成，抑制VEGF和ICAM-1的表達阻斷滑膜血管新生，抑制炎癥細胞浸潤與滲出有關。