甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物危害初步分析

劉俊菲，林 鳳，毛瑞豐*，李 凱,2，陸翠華

（1廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004；2廣西甘蔗制糖中心，廣西南寧530004；3南寧糖業股份有限公司伶俐糖廠，廣西南寧530211）

0 引言

甘蔗的種植和制糖以印度為最早[1]，甘蔗制糖在我國也有悠久的歷史，白糖和冰糖制造技術可以追溯到唐朝。然而，甘蔗糖廠車間環境中存在著大量的微生物，主要以微生物氣溶膠形式存在，進而傳播到成品糖造成產品品質下降。微生物氣溶膠指的是氣溶膠中有生命活性的部分，囊括空氣中的病毒、細菌、真菌等具有生命活性的微小粒子[2]，按照生物學種類，可以將微生物氣溶膠劃分為真菌氣溶膠、細菌氣溶膠。微球菌和表皮葡萄球菌是室內細菌微生物普遍存在的一種微生物[3]。煙曲霉和雜色曲霉是導致室內真菌污染的主要菌株[4]，雜色曲霉能使甘蔗變質產生可溶性紅色色素，使潮包變紅[5]。真菌菌株在適宜的條件下可以產生次級代謝產物，如：揮發性真菌代謝物（VFM）、（1-3）-β-D 葡聚糖、麥角甾醇及霉菌毒素。其中腸膜明串珠菌是甘蔗糖廠生產及加工中主要的有害菌株，其危害是產生葡聚糖，造成“蔗飯”，產生大量泡沫，嚴重影響產品質量[6]。

甘蔗制糖工藝包括原料預處理、提汁、清凈、蒸發、煮糖結晶、離心、干燥、包裝等工藝。煮糖之前的微生物來源廣泛，其危害主要體現在對生產工藝及生產效率上；而經過蒸發、煮糖等高溫殺菌作用后對成糖工序影響較小。甘蔗糖廠成糖潔凈區是指煮糖之后的部分，其微生物來源主要是車間環境和空氣中的微生物，研究結果顯示檢出的致病菌主要來自于成糖潔凈區[7-8]。因此，系統研究甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物危害控制是必不可少的，合理的車間氣流組織分布是減少和控制成糖潔凈區微生物危害發生及傳播的主要因素之一。

本文采用傳統微生物學鑒定方法和分子生物學鑒定相結合的方式，實現甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物鑒定，通過指標性微生物的系統發育分析，找出成糖潔凈區潛在的污染途徑及污染源，從而為甘蔗制糖行業微生物危害控制技術規范研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 采樣工具

試管、小鋁盒、鑷子、平板、5 cm×5 cm采樣規格板、鐵鏟、棉拭子、酒精棉球、封口膠。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，蔗糖（葡萄糖）20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1000 mL，pH自然，121℃滅菌15 min；沙氏培養基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121℃滅菌15 min；牛肉膏蛋白胨培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 值 7.3±0.2（25℃），121℃高壓蒸汽滅菌 20 min；胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖 2.5 g，蒸餾水 1000 mL，pH 值 7.3±0.2（25℃），121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

傳統微生物學鑒定所需試劑：結晶紫、碘單質、95%乙醇、番紅等，均為分析純。

核酸提取及聚合酶鏈反應（PCR）所需試劑：細菌DNA提取試劑盒（購于TaKaRa）；真菌DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；Premix TaqTM（購于 TaKaRa）；27F/1492R 通用引物（購于北京六合華大基因科技股份有限公司）；ITS1/ITS4通用引物（購于北京六合華大基因科技股份有限公司）；瓊脂糖（購于 Biowest，西班牙）；4S Red Plus核酸染色劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

電泳緩沖液儲存液（5×TBE）：Tris 54 g，硼酸27.5 g，EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）20 mL，蒸餾水 1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采樣方法、風速、風向、溫濕度測定方法

環境空氣采樣[9]、設備表面采樣、生產線采樣及糖垢采樣點采樣參考GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》；利用AM-4812風速儀和飄帶法以及 AT7592指南針測定風速、風向；利用溫度計和濕度測定儀對溫濕度進行測定。

1.2.2 菌落總數測定及分離純化方法

生產線樣品、糖垢樣品及設備表面樣品的菌落總數測定方法參考GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》，略作改動地方為：每次取菌液時加入5 min的渦旋震蕩，用來達到混勻的目的。而關于空氣環境樣品菌落總數的測定，則是參照《甘蔗糖成品霉菌污染的微生物學分析》及《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。細菌分離純化采用的是平板劃線分離法；真菌的分離純化采用的是三點接種法。

1.2.3 16S rRNA[10]和ITS[11]基因序列分析

利用細菌基因組 DNA提取試劑盒、真菌基因組 DNA提取試劑盒對甘蔗糖廠成糖潔凈區菌株進行DNA提取，方法可參考試劑盒說明書。利用通用引物27F/1492R[12]、ITS1/ITS4對基因組進行核酸聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增，PCR反應體系如表1、表2所示。擴增出16S rRNA和ITS基因片段，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳，驗證基因組提取結果及擴增結果，條帶明亮的樣品送至測序公司進行測序。通過利用美國國家生物技術信息中心（National Center For Biotechnology Information，NCBI）網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行基因序列比對，從而確定菌株的相似性。首先利用DAMBE軟件進行堿基替換飽和分析，進而利用 PAUP*4.0b10軟件中的最大似然法（Maximum Likehood，ML）和 MrBayes×64 軟件中的貝葉斯法（Bayesian，BI）構建系統發育樹。

表1 PCR反應液的組成

2 結果與分析

2.1 菌落總數的測定分析

甘蔗糖廠成糖潔凈區中環境空氣、設備表面、生產線及糖垢等采樣點位置及風速測定見圖 1，環境空氣、設備表面、生產線及糖垢等采樣點的細菌菌落數和真菌菌落數見表3、表4、表5和表6，結果顯示成糖潔凈區不同采樣點均存在菌落總數嚴重超標的問題。

圖1 所有樣品取樣點（箭頭方向代表風速方向）

表3 環境空氣取樣點的菌落總數及采樣點位置

表4 設備表面取樣點的菌落總數及采樣點位置

環境空氣總共選取了20個采樣點，在A-7、A-20采樣點細菌蓄積嚴重，在A-7、A-16采樣點真菌蓄積嚴重。設備表面總共選取了21個采樣點，在B-9、B-11、B-12、B-21采樣點細菌菌落總數分別達到了6.8×103、1.4×103、3.0×105、3.4×104CFU/cm2，最高達到了 105數量級，在 B-6、B-9、B-15、B-21采樣點真菌菌落總數分別達到了 5.3×104、2.5×103、2.3×103、1.0×103CFU/cm2，最高達到了 104數量級。糖垢采樣總共選取了8個采樣點，在C-1、C-2、C-3、C-4采樣點細菌菌落總數分別達到了1.8×103、1.6×103、1.5×103、3.0×102CFU/g，而在C-1、C-3、C-4采樣點真菌菌落總數分別為70、20、20 CFU/g。生產線采樣總共選取了6個采樣點，在D-3采樣點細菌菌落總數最高達1.0×102CFU/g，在D-2、D-3采樣點真菌菌落總數分別為2.0×102、1.0×102CFU/g。風速測定總共選取了14個采樣點，通過風速的測定，發現有 3個采樣點風速分別為36.5、6.0、4.0 m/s，其它風速點，風速均小于 1.0 m/s。

表5 糖垢取樣點及采樣點位置

表6 生產線取樣點的菌落總數及采樣點位置

從菌落總數測定結果可知，甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物污染嚴重的地方主要集中于一級振篩、9號分蜜機落糖口（位于一級振篩）、二級振篩及三級振篩周圍，且設備表面采樣點的菌落總數高于生產線及糖垢采樣點的菌落總數，其主要原因是由于落糖口區域溫濕度較大，帶有大量水分的成品糖使此區域的溫濕度增大，如最高溫度達28℃，最高相對濕度達 71%，又發現糖粉分布于整個成糖潔凈區，再加之測得的一級振篩區域氣流分布成交叉狀態，所以增加了環境微生物及設備表面微生物的蓄積及傳播。而生產線及糖垢采樣點菌落總數測得結果較少的原因有可能是進入到成糖工序造成真菌污染產生真菌孢子，但隨著成糖工序輸送帶的輸送作用，蔗糖的水分含量也逐漸減少，從而不適宜真菌孢子的生長，進而檢測不出成品糖受到的微生物危害。

2.2 傳統微生物學鑒定及系統發育分析

為確定甘蔗糖廠成糖潔凈區中污染微生物的種類，結合菌落形態觀察、顯微結構觀察以及生理生化實驗、對所獲得的未知菌株進行了初步鑒定。結果發現，細菌菌株多數為革蘭氏陽性的芽孢桿菌（Bacillus）、球菌[3]，而真菌菌株多數為青霉屬（Pencillicun）、曲霉屬（Asperigillus），還有少數的紅酵母屬（Rhodotorula）。

同時，利用分子生物學技術對甘蔗糖廠成糖潔凈區鑒定出163株細菌，主要有克氏庫克菌（Kocuria kristinae）[13]、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、高地衣芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）[14]、 腐 生 葡 萄 球 菌（Staphylococcus saprophyticus Subsp.）等；鑒定出 97株真菌，主要包括粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、米 根 霉 （Rhizopus oryzae）、 煙 曲 霉 （Aspergillus fumigatus）[15]、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、黃曲霉 （Aspergillus flavus）[16]、 黑 曲 霉 （Aspergillus puniceus）、桔青霉（Penicillium citrinum）[17]、離生青霉 （Penicillium solitum）、 枝 孢 霉 （Cladosporium halotolerans）、木霉（Trichoderma harzianum）等。

此外，利用部分真菌菌株鑒定結果構建系統發育樹（圖2）。從系統發育樹鑒定結果可知，系統樹分為2大類分支。第一大類分支能夠將3株供試菌株鑒定到種水平，且供試菌株與模式菌株的后驗概率值在0.90以上，說明供試菌株鑒定結果的可信度較高，菌株親緣關系較近；第二大類分支較復雜且有很多拓撲結構及分支，可將13株供式菌株鑒定到種水平，菌株之間的親緣關系也是由后驗概率值大小的變化轉換成菌株親緣遠近的關系。通過利用指標性微生物菌株構建系統發育樹，找出菌株的親緣關系，通過菌株的親緣關系確定菌株的進化關系，從而判斷菌株的直系親屬關系。最后，通過菌株的直系關系及進化途徑可以確定菌株的污染傳播途徑，結果如圖3所示。

圖2 運用BI在MrBayes×64中對供試菌株的ITS構建系統發育進化樹

圖3 甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物危害分析流程圖

分子系統發生是利用各種分子性狀構建的生物實體之間起源和演化關系。采用的分子數據主要是DNA和蛋白質序列。DNA和蛋白質序列數據作為生物信息分子具有線性數字編碼特征，并且能夠建立位點之間的同源關系，逐漸成為系統發生分析的主要數據來源[18]。結果如圖 4[19]所示，以分布在不同采樣點的枯草芽孢桿菌為指標性菌株，通過系統發育分析，發現分支點c與d的親緣關系較近，也

就意味著具有相同的直系菌株即菌株的來源相同，而分支點b的親緣關系逐漸較遠。從而可以判斷菌株的進化發育次序是從節點 A到節點 F的進化發育，即溯源環境菌株是否進入到成品糖中并具有直系關系，再結合車間氣流組織分布，論證了氣流組織分析獲得的污染傳播途徑與菌株進化發育次序獲得的污染傳播途徑相一致。

2.3 甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物危害初步分析

圖4 運用BI在MrBayes×64中對枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列構建系統發育進化樹[19]

對甘蔗成糖潔凈區微生物危害分析，首先是從指標性微生物的污染源及污染途徑分析，其次是從檢出菌株的危害分析及污染源的判斷分析。指標性微生物是指分布在甘蔗糖廠成糖潔凈區各個生產線采樣點且同時分布在其它各個采樣點中最多的同一種菌株。游彪[19]研究結果選擇枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）作為細菌和真菌菌株的指標性微生物。

通過指標性微生物構建系統發育樹，可以找出菌株間的親緣關系和直系菌株。通過系統發育分析，圖4發現分支點c與d的親緣關系較近，也就意味著具有相同的直系菌株即菌株的來源相同，而分支點b的親緣關系逐漸較遠。從而判斷菌株的進化發育次序是從節點A到節點F的進化發育，再結合車間氣流組織分布，發現枯草芽孢桿菌進化發育過程和成糖潔凈區不同工序枯草芽孢桿菌菌株的污染傳播途徑相一致，從而為甘蔗糖廠成糖潔凈區車間環境菌株進入到成品糖的污染傳播途徑得到證明。結合檢出菌株，發現成糖潔凈區檢出黃曲霉分布于B-4、B-12、B-15、B-18、B-21等采樣點，根據甘蔗糖廠成糖潔凈區物料流動方向及物料特性，蓄積在生產線上的糖垢為生產線上的微生物繁殖提供了一定的生存環境，隨著物料的流動，從成糖工序傳播到下一成糖工序，并造成二次污染，隨著帶有大量水分的成品糖不斷的沖擊落糖口積垢處，為微生物傳播提供動力。另一方面，通過氣流組織測定，三級振篩中端測定的進氣管口風速較大，達 36.5 m/s，且測定的此處區域的氣流成交叉狀態，其他不同采樣點區域也存在氣流分布紊亂。因此，將發現的2條主要污染途徑歸為生產線上物料的流動和車間氣流組織的流動。

檢出菌株的危害分析是依據檢出菌株本身的微生物危害及對甘蔗糖廠成糖潔凈區成品糖的危害進行分析。根據實驗結果，檢出大量具有致病性菌株及具有產色素能力的污染傳播菌株，致病性菌株分為疑似常見致病菌株和疑似條件致病菌，它們能夠產生金黃色葡萄球菌毒素、黃曲霉毒素和桔霉素等，而且產色素能力的菌株也會對成品糖的色澤和品質造成影響，而通過致病菌微生物的傳播也會造成甘蔗糖的安全性隱患。

根據污染菌株的風險等級如致病性、產色素能力及普遍性可將污染菌株進行危害等級劃分，分為高度風險菌株、中度風險菌株、低風險菌株、可能性高風險污染菌株、可能性中度風險菌株及可能性低度污染菌株等6類。如高風險菌株有蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、桔青霉（Penicillium citrinum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）；根據結合取樣點信息、菌落總數及污染菌株風險等級，將污染源危害等級劃分為高度風險污染源、中度風險污染源、低風險污染源、可能性高風險污染源、可能性中度風險污染源及可能性污染源。高風險污染源有B-4、B-12、A-19、A-16、B-21等。

3 結論

通過對甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物危害分析，結合菌落總數測定結果，發現潔凈區微生物污染嚴重的地方主要集中于一級振篩、9號分蜜機落糖口（位于一級振篩）、二級振篩及三級振篩周圍，且設備表面采樣點的菌落總數高于生產線及糖垢采樣點的菌落總數。

通過系統發育分析，可以找出菌株間的親緣關系和直系菌株及菌株的進化發育次序，再結合車間氣流組織分布，論證了氣流組織分析獲得的污染傳播途徑與菌株進化發育次序獲得的污染傳播途徑相一致。最后，將生產線上物料的流動和車間氣流組織的變化作為甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物污染的主要途徑和普遍性規律，從而為甘蔗糖廠成糖潔凈區微生物危害分析奠定了理論基礎。