淫羊藿女貞子配伍提高哮喘大鼠對地塞米松作用的敏感度研究

高瑩瑩 唐秀鳳 李曉曦 陳宇恒 于 萍 劉仁慧

哮喘是以氣道慢性炎癥為特征的呼吸系統的常見疾病之一，目前發生率和致死率逐年上升，并在全世界范圍內都嚴重威脅公眾健康[1]。哮喘治療的首選藥物糖皮質激素(glucocorticoids，GC)雖有強大的抗炎作用，但長期或大劑量應用卻容易造成嚴重的難以解決的不良反應[2]。GC作為為甾體激素，發揮抗炎作用的機制是結合胞質內的糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)，啟動基因轉錄進程，合成相應的發揮抗炎作用的蛋白質[3]。胞質內GR在未被激活時結合2分子的熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)，使GR維持預備結合的狀態[4]。筆者在前期實驗研究中發現，淫羊藿女貞子合用地塞米松對卵蛋白誘導的哮喘大鼠能產生協同抗炎、下丘腦-垂體-腎上腺軸及提高GR的結合力，并證實中藥合用布地奈德氣道吸入緩解哮喘的機制與調整GR/HSP90的比值有關[5～7]。但對淫羊藿女貞子合用全身給藥的GC——地塞米松對GR/HSP90的影響作用尚未明確。

材料與方法

1.實驗動物：雄性 SD 大鼠，SPF 級，體重120±10g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

2.試劑與藥品：卵清白蛋白(美國 Sigma公司，A5253-250G)，氫氧化鋁(北京化工廠，批號：20120028)，地塞米松磷酸鈉注射液(5毫克/支，國藥集團容生制藥有限公司，批號：H41020036)，HSP 90、GRα一抗，均購自英國Abcam公司，GRβ一抗(biorbyt，E10827)；小鼠抗β-actin抗體、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG、 DAB顯色液均購自中杉金橋，RIPA裂解液(Solarbio，20150517)，Trizol購自美國Invitrogen公司，M-MLV反轉錄酶、dNTP(10mmol/L)、Ex TaqMix，均由寶生物工程(大連)有限公司提供，引物由上海生工有限公司合成。

3.儀器：402A超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備有限公司)，電泳槽(日本TaKaRa公司)，7500型PCR儀(美國ABI公司)，Chromo4熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(韓國Korea Biotech公司)。

4.動物分組及藥物制備方法：42只大鼠隨機分為7組，即正常組(N組)、模型組(A組)、地塞米松組(Dex組)、淫羊藿女貞子煎劑組(YN1組)、淫羊藿女貞子煎劑合地塞米松組(YN1&Dex組)、淫羊藿女貞子提取物組(YN2組)和淫羊藿女貞子提取物合地塞米松組(YN2&Dex組)，每組均為6只。淫羊藿女貞子煎液和淫羊藿女貞子提取物制備方法見參考文獻[8,9]。

5.造模、給藥及取材：參考文獻[10]方法于實驗第1～35天，除N組外，其他動物進行造模。Dex組、YN1組、YN1&Dex組、YN2組、YN2&Dex組的給藥方法同參考文獻[11]。第36天處死動物，開胸，取左肺組織，部分4%甲醛固定，其余液氮凍存。

6.檢測方法：免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)及Western blot(WB)法檢測肺組織GRα、GRβ、HSP90的蛋白表達，RT-PCR法檢測大鼠的肺組織中GRα、GRβ以及HSP90的 mRNA的表達，具體檢測方法同前[4]。詳見表1。

表1 GRα、GRβ以及HSP90引物序列

結 果

1. 各組大鼠肺組織中GRα表達的比較：與正常組相比，模型組和地塞米松組的大鼠肺組織中GRα蛋白及mRNA表達量都明顯下調(P<0.05或P<0.01)；地塞米松組與模型組相比 GRα mRNA表達量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用均能明顯上調GRα 蛋白(WB法檢測)及mRNA表達(P<0.05或P<0.01)。與地塞米松組比較，淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用仍能顯著上調GRα 蛋白(WB法檢測)及mRNA表達(P<0.05或P<0.01，表2)。

表2 各組大鼠肺組織中GRα表達的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.各組大鼠肺組織中GRβ 表達的比較：與正常組相比，模型組中GRβ 的mRNA表達量明顯上調(P<0.05)，地塞米松組GRβ 蛋白及mRNA量均明顯上調(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，地塞米松組GRβ 蛋白的IOD值顯著上調(P<0.05)；淫羊藿女貞子提取物組GRβ 蛋白的陽性面積值顯著降低(P<0.05)；中藥淫羊藿女貞子單用組以及淫羊藿女貞子與地塞米松合用組GRβ mRNA的表達均明顯降低(P均<0.01)。與地塞米松組比較，淫羊藿女貞子單用組及淫羊藿女貞子與地塞米松合用組的GRβ 蛋白表達的IOD值和 mRNA的表達都明顯降低(P均<0.01)，GRβ 蛋白表達的陽性面積值淫羊藿女貞子提取物合地塞米松組差異無統計學意義，而WB法檢測GRβ 蛋白表達是淫羊藿女貞子與合地塞米松的兩個合用組比較，差異有統計學意義(P均<0.01，表3)。

表3 各組大鼠肺組織GRβ 表達的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.各組大鼠肺組織中HSP90表達的比較：與正常組比較，模型組表達的HSP90蛋白和mRNA均明顯降低(P<0.01)；地塞米松組HSP90蛋白(IOD值及WB法檢測)及mRNA表達也顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，地塞米松組各值差異無統計學意義(P均>0.01)；其余給藥組HSP90蛋白(陽性面積值及WB法檢測值)及mRNA的表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與地塞米松組比較，淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用共4組均能顯著上調HSP90蛋白(WB法檢測值)及mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)，淫羊藿女貞子提取物與地塞米松合用組對IHC法檢測的HSP90蛋白含量均明顯上調(P<0.05,表4)。

表4 各組大鼠肺組織HSP90表達的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4.各組大鼠肺組織GRα/GRβ的比較：與正常組比較，模型組及地塞米松組GRα/GRβ 比值在蛋白及mRNA水平均顯著降低(P均<0.01)。分別與模型組和地塞米松組比較，淫羊藿女貞子與地塞米松兩個合用組在蛋白及mRNA水平上均可上調GRα/GRβ比值(P<0.05或P<0.01,表5)。此外，相關分析結果顯示， GRα 與GRβ 在蛋白及mRNA水平的相關系數r值分別為-0.566(P=0.000)和-0.495(P=0.001)。

表5 各組大鼠肺組織GRα/GRβ的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

5.各組大鼠肺組織GR亞型/HSP90的比較：與正常組比較，模型組GRα/HSP90在mRNA水平及HSP90/GRβ在蛋白水平均明顯降低(P均<0.01)；地塞米松組GRα/HSP90 在mRNA水平及GRβ/HSP90在蛋白及mRNA水平均顯著降低(P均<0.01)。分別與模型組及地塞米松組比較，淫羊藿和女貞子的單用、淫羊藿女貞子與地塞米松合用組均能調整GRα/HSP90、GRβ/HSP90在mRNA水平上的比值(P均<0.01)；淫羊藿女貞子與地塞米松合用組能顯著抑制GRβ/HSP90在蛋白水平的比值(P<0.05或P<0.01)。此外，相關分析結果顯示， HSP90與GRα 在蛋白及mRNA水平的r值分別為0.708(P=0.000)和0.535(P=0.000)；HSP90與GRβ 在蛋白及mRNA水平的r值分別為-0.476(P=0.004)和-0.368(P=0.019,表6)。

表6 各組大鼠肺組織HSP90/GR亞型的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

討 論

哮喘的發病機制與GR損傷有關，包括GR的數量下降、結構缺陷以及基因表達調控的改變等[12]。而使用外源性GC，會使GR的缺陷更加嚴重，表現為哮喘患者對激素的反應性下降。GR有兩種主要的亞型，GRα 和GRβ。GRα 可激活經典激素效應，而GRβ不直接與GC結合，而是與GRα 存在拮抗關系起作用[13]。GRβ表達的增加與GC敏感度降低有明確關系[14，15]。GC 抵抗的發生可能是與GRα 與GRβ 比值失衡有關[16]。筆者研究發現，哮喘模型及地塞米松組GRα 蛋白和mRNA表達均明顯降低，哮喘模型組GRβ mRNA表達顯著上調，地塞米松組GRβ 蛋白及mRNA表達均明顯上調。哮喘大鼠經地塞米松治療后GRβ蛋白表達的上調提示哮喘大鼠對激素作用的敏感度降低，可能增加了GC抵抗的發生。而哮喘大鼠被給予地塞米松合用淫羊藿女貞子煎液或提取物治療后，GRα 的表達明顯增加，且GRβ 的表達被抑制，調整GRα/GRβ 的比值，提示改善GR亞型的表達及GRα/GRβ的失衡狀態，可能是中藥提高哮喘大鼠對激素作用敏感度的部分機制。

熱休克蛋白HSP90是GR的分子伴侶，可以激活GR使其發揮作用。在正常情況下，HSP90可以改變GR的立體構象，使GR形成能與GC結合的特異性構象，從而使GR可與GC結合。也就是說HSP90與GR的配體的結合域結合后，GR才能與GC高效聯結發揮作用。所以HSP90減少，會使GR上與GC結合的位點的立體結構不能與GC特異性結合，雖然有證據表明不與HSP90結合的GR也可以接受GC刺激，但對于GC的敏感度是降低的[17]。

HSP90不僅是能使GR激活成可結合狀態使其順利發揮作用，即HSP90的存在可增加類固醇激素的敏感度；另一方面在激活GR后，HSP90對GC的作用效果也起到調節作用 ，即當HSP90與GR之比適當時，可增加GC的作用效果；而HSP90與GR之比不在正常范圍內則可以降低GC的作用效果。本研究數據結果顯示，哮喘模型組HSP90的蛋白表達量和其mRNA表的達量均明顯下調，同時GRα與 HSP90 的mRNA量之比明顯降低，而GRβ/HSP90比值顯著升高。淫羊藿女貞子煎劑和水提物與地塞米松合用后，HSP90 表達顯著上調，GRα/HSP90 或GRβ/HSP90均有顯著的改善。提示中藥淫羊藿女貞子調整哮喘大鼠對GC作用的敏感度與上調HSP90 表達，調整GR亞型與HSP90的比值有關。