夏枯草醇提物抑制腫瘤細胞的研究

楊亞冬 羅 濤 楊 耿 徐怡朦 張文元

夏枯草(Prunella vulgaris L)，為多年生草本植物，匍匐根莖，節上生須根。性寒，味苦、辛。 具有清火明目，散結消腫之功效。夏枯草主要含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機酸、揮發油及糖類等成分[1,2]。各個成分之間可能存在著協同或抑制的作用，其藥理作用廣泛，已有較多對于其抗腫瘤機制的研究，主要圍繞抑制腫瘤細胞增殖和轉移展開。本實驗采用水提醇沉法將夏枯草成分分成醇溶出部分和醇沉淀部分，并就這兩部分藥物對肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用及其抑制細胞遷移作用進行研究。

材料與方法

1.藥品與試劑：夏枯草(符合2015年版《中華人民共和國藥典》)購自安徽省亳州市網上藥店藥掌柜，低糖DMEM培養基(LG - DMEM ，美國Gibco公司)，胰蛋白酶 (美國Sigma公司)，噻唑藍[MTT，生工生物工程(上海)有限公司]、二甲基亞砜(DMSO)。

2.儀器耗材：CKX41熒光相差倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)，3111型CO2培養箱 (美國Thermo公司)， 酶標儀(美國Thermo公司)，96孔板(美國Corning公司)，25cm2培養瓶(美國Corning公司)細胞株：人肺腺癌細胞系A549細胞為本研究所保存(上海中國科學院細胞庫)。人肝癌細胞系HepG2細胞為本研究所保存(上海中國科學院細胞庫)。

3.水煮醇沉法提取夏枯草[3,4]:水煮：稱取夏枯草生藥30g，用去離子水清洗一遍，加40～50℃的去離子水800ml浸泡1h，然后置砂鍋內煎，待藥液沸騰后，再煎40min倒出煎液，在藥渣內再加適量的水煎1次，將兩次得的煎液混合，進行加熱濃縮至生藥含量為0.5g/ml的煎液。靜置至室溫后用濾紙進行粗濾，收集濾液用于進一步提取。醇沉：將粗濾后的水煎液放恒溫磁力攪拌器上80℃加熱濃縮藥液。待冷卻至室溫后邊攪拌邊緩慢加入適量95%乙醇溶液，使乙醇終濃度達到80%以上，4℃冰箱靜置過夜，1570×g離心，10min，將沉淀和上清分開。沉淀放平皿里凍干，稱重后待用，上清收集后放恒溫磁力攪拌器上80℃加熱，使乙醇充分蒸發，最后得醇提的濃縮液，生藥含量為5g/ml。

4.細胞的準備：分別將A549和HepG2細胞復蘇，加L-DMEM完全培養基(含10%胎牛血清、1%抗生素)置37℃、5%二氧化碳培養箱培養，每隔2～3天換液，倒置顯微鏡觀察，待細胞長到80%～90%融合后0.25%胰酶消化，各自傳代培養。

5.MTT法檢測不同濃度夏枯草提取物對細胞增殖力的影響:分別取A549和HepG2細胞懸液以1×105cells/ml濃度接種96孔板，每孔100μl，培養24h；棄上清，加入配制好的各種濃度的藥液，200微升/孔，每個濃度設3個復孔，顯微鏡觀察細胞形態變化，并拍照記錄； 48h后，吸棄上清，每孔加入500μg/ml MTT 100μl，37℃靜置避光培養4h，棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜；室溫振蕩10min使沉淀結晶完全溶解，酶標儀490nm波長檢測每孔的吸光度A值。根據吸光度計算不同時間不同濃度的中藥對細胞的增殖抑制率。實驗重復4次，增殖抑制率IR(%)=(實驗對照組A值-藥物處理組A值)/(實驗對照組A值-空白組A值)×100%。

6.細胞劃痕法觀察藥物對細胞遷移能力的影響:將A549和HepG2細胞均以5×104cells/ml分別鋪在24孔板中，每孔1ml細胞懸液，培養24h后，形成單細胞層。用10μl移液槍槍頭沿著尺子在每孔的中央呈“一”字劃痕，用PBS液輕輕沖洗2次，洗去劃下來的細胞。實驗組中加入不同濃度的夏枯草提取物溶液，夏枯草提取物用不含牛血清的高糖基礎培養基(HG-DMEM)進行配制，空白對照組加入HG-DMEM基礎培養基。37℃作用24h后，吸去上清，加入含10%牛血清的完全培養基，在培養24h和48h時，顯微鏡下觀察各組細胞向劃痕中央遷移生長情況并拍照。

結 果

1.夏枯草提取物濃度計算：夏枯草醇沉淀物濃度按生藥量計算為5.0g/ml，夏枯草醇溶解物濃度按生藥量計算為5.0g/ml。

2.夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用：MTT結果表明，夏枯草醇沉淀物對A549細胞和HepG2細胞的生長增殖抑制作用在濃度為1g/ml時最顯著，A值分別為0.174±0.044和0.127±0.006(圖1)，兩種細胞的增殖抑制率分別為0.826%±0.044%和0.872%±0.006%，細胞的增殖抑制率與藥物濃度呈正相關，濃度越高，對細胞的增殖抑制作用越強，增殖抑制率為負數時，表示藥物在該濃度對細胞無抑制作用(圖2)。夏枯草醇溶解物對A549細胞和HepG2細胞的生長增殖抑制作用并非濃度越高作用越強，而是在濃度為0.1g/ml時最顯著，A值分別為0.156±0.022、0.124±0.003(圖1)，兩種細胞的增殖抑制率分別為84.30%±2.21%、87.41%±0.25%，濃度在0.1～1.0g/ml區間內，藥物濃度與兩種細胞的增殖抑制率呈負相關，濃度<0.1g/ml后藥物對細胞增殖抑制作用迅速減弱，到0.05g/ml時基本無抑制作用(增殖抑制率為負數，表示藥物在該濃度對細胞無抑制作用,圖2)。

圖1 不同濃度夏枯草兩種醇提物對A549和HepG2細胞作用48h后A值比較

圖2 不同濃度夏枯草兩種醇提物對A549和HepG2細胞作用48h后增殖抑制率比較

3.夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞作用48h后，細胞形態的變化:A549細胞在藥物作用48h后顯微鏡下可見：夏枯草醇沉淀物濃度為1.0g/ml時細胞呈圓縮狀，狀態差，濃度為0.5g/ml時，細胞狀態較1.0g/ml時好，但仍有不少細胞呈圓縮狀，濃度為0.1g/ml時細胞基本恢復正常，均呈貼壁生長，見圖3A。夏枯草醇溶解物濃度為1.0g/ml和0.5g/ml時細胞狀態良好，但較正常對照細胞數量少，濃度為0.25g/ml時細胞開始出現圓縮狀態，濃度為0.1g/ml時更甚，細胞數量也顯著減少，濃度為0.05g/ml時細胞又恢復正常的狀態，見圖3B。細胞狀態與MTT結果相符。

HepG2細胞在藥物作用48h后顯微鏡下可見：夏枯草醇沉淀物濃度為1.0g/ml時細胞呈圓縮狀，狀態差，濃度為0.5g/ml時，細胞狀態較1.0g/ml時好，但仍有不少細胞呈圓縮狀，濃度為0.1g/ml時細胞基本恢復正常，均呈貼壁生長，見圖4A。夏枯草醇溶解物濃度為1.0g/ml和0.5g/ml時細胞狀態良好，但較正常對照細胞數量少，濃度為0.25g/ml時細胞數量減少，開始出現圓縮狀態，濃度為0.1g/ml時更甚，細胞數量顯著減少，濃度為0.05g/ml時細胞又恢復正常的狀態，呈現島狀生長，見圖4B。

4.夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞體外遷移能力的影響:細胞劃痕實驗結果發現夏枯草醇沉淀物與醇溶解物在濃度為0.5g/ml、0.25g/ml作用細胞24h后，A549細胞在正常培養基條件下培養24h和48h后均未出現細胞垂直于劃痕方向增殖遷移。醇沉淀物與醇溶解物濃度為0.1g/ml、0.05g/ml時，A549細胞出現向垂直于劃痕方向的增殖遷移。醇溶解物高濃度組未出現細胞遷移，但是細胞狀態較低濃度組好，0.1g/ml濃度組雖然出現細胞遷移現象，但細胞出現圓縮，細胞數量顯著減少,見圖5。

圖3 不同濃度夏枯草醇提物作用A549細胞48h后顯微鏡下觀(×100)

圖4 不同濃度夏枯草醇提物作用HepG2細胞48h后顯微鏡下觀(×100)

圖5 不同濃度夏枯草提取物作用A549細胞24h后，再培養不同時間細胞遷移情況顯微鏡下觀察(×100)

HepG2細胞劃痕實驗結果發現夏枯草醇沉淀物與醇溶解物在濃度為0.5g/ml、0.25g/ml作用細胞24h后，在正常培養基條件下培養24h和48h后均未出現細胞垂直于劃痕方向增殖遷移。醇沉淀物與醇溶解物濃度為0.1g/ml、0.05g/ml時，HepG2細胞出現向垂直于劃痕方向的增殖遷移,劃痕邊線變得不整齊，0.1g/ml濃度時，醇沉物組較醇溶物組細胞遷移生長顯著，48h后已經出現劃痕基本融合的情況。醇溶解物各組雖然高濃度組未出現細胞遷移，但是細胞形態較低濃度組正常，0.1g/ml濃度組雖然出現細胞遷移現象，但細胞出現圓縮，細胞數量顯著減少,見圖6。

討 論

夏枯草所含的化學成分非常復雜，不同提取法獲得的成分不同，Lee等[5]用甲醇從夏枯草中分離到了15種三萜類、4種黃酮類、4種酚醛樹脂和1個雙萜類，各種成分具體發揮什么作用目前尚未有非常明確地定義。其中三萜類、黃酮類、多糖類具有明確地抗腫瘤作用[6～9]。由于其化學成分復雜，其抗腫瘤作用的機制也呈多樣性，是中藥“多組分，多靶點”的典型代表[10]。可能與調節細胞內Ca2+平衡、維護細胞的穩態和調節細胞周期的變化，抑制腫瘤細胞增殖和轉移、調節細胞能量代謝有關[11]。馮春來等[12]通過對夏枯草相關的中藥腫瘤通路分析，明確了39種成分能作用于22條腫瘤相關通路，各通路間錯綜復雜，形成網絡狀抗腫瘤效果。本實驗采用水提醇沉法對夏枯草進行粗提,來研究其成分抗腫瘤細胞的效果，并分析出現該結果可能的因素。

圖6 不同濃度夏枯草提取物作用HepG2細胞24h后，再培養不同時間細胞遷移情況顯微鏡下觀察(×100)

水提醇沉法就是利用藥物中某些成分能溶于乙醇而某些成分不溶于乙醇的特性初步獲得想要的中藥成分，在加入乙醇后，部分成分轉溶于乙醇中而另外的則被沉淀出來。醇濃度不同，沉淀出來的藥物成分不同，通常當含醇量達80%時，幾乎可沉淀全部淀粉、多糖、蛋白質、無機鹽類物質[13]。本實驗用80%的乙醇提取后，將夏枯草水提液分成兩部分，沉淀部分主要含有糖類、有機酸鹽、各種親水性的苷類及蛋白質；醇溶出部分主要含有親脂性成分如三萜皂苷元、甾體苷元、黃酮苷元、香豆素等，并比較研究了這兩部分提取物對A549和HepG2細胞的作用。MTT結果顯示，夏枯草醇沉淀物對A549細胞和HepG2細胞的生長增殖抑制作用在高濃度1.0g/ml時最顯著，均在80%以上，而夏枯草醇溶解物對上述兩種細胞的生長增殖抑制作用并非濃度越高作用越強，而是在濃度為0.1g/ml時最顯著，醇沉淀物在0.1g/ml這個濃度時，對兩種細胞均無抑制作用。醇沉淀物在0.25～1.0g/ml濃度范圍內，細胞的增殖抑制率與藥物濃度呈正相關，濃度越高，對細胞的增殖抑制作用越強，低于0.25g/ml后基本無抑制作用。醇溶解物濃度在0.1～1.0g/ml區間內，藥物濃度與兩種細胞的增殖抑制率呈負相關，濃度低于0.1g/ml后藥物對細胞增殖抑制作用迅速減弱，到0.05g/ml時基本無抑制作用。

醇溶解物為何會出現中間濃度對細胞增殖抑制作用最強？筆者分析原因可能與中藥復雜的多維組分結構有關。中藥具有中藥物質基礎、組分及單體這3個層次的多維組分結構，單體具有明確地化學結構式及明確地藥理藥效，組分是由同一類別的單體成分構成，組分中各單體成分間存在配伍配比關系，中藥物質基礎由多個組分構成，各組分間也存在配伍配比關系，所以各個層次中單體或組分結構比例不同會直接影響藥理藥效[14]。醇溶解物中主要成分是三萜類,還有其他脂溶性成分，劉文博[15]的研究結果中提到夏枯草三萜類生藥濃度在0.05～0.4g/ml范圍內對A549細胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性，濃度越高，抑制作用越強，與醇溶解物在0.05～1.0g/ml濃度范圍內呈“V”字型的抑制作用結果不一致，所以可能存在其他成分在同時發揮拮抗效果，且作用效果較三萜類更強，導致在高濃度藥物作用下腫瘤細胞反而生長狀態良好。岳慶喜等[16]發現三萜類與其他抗腫瘤藥物合用效果依賴于該兩種藥物的作用強度，當一種藥物的作用強于另一種時發揮協同作用，當兩種藥物作用相似時發揮拮抗作用。另一種解釋是夏枯草醇溶解物各個單體或組分間的配比在濃度為0.1g/ml時達到了最佳配伍狀態，協同發揮出最強的抑制腫瘤細胞增殖的效果。

細胞形態學的結果與MTT結果非常吻合，在增殖抑制率高的組，細胞呈圓縮狀，數量上也較正常對照少，在醇沉淀1.0g/ml組和醇溶解物0.1g/ml組細胞狀態較其他組都差。這結果提示夏枯草醇沉物和醇溶解物中的有效成分均對細胞有直接的殺傷作用，通過抑制細胞增殖來發揮抗腫瘤作用。

細胞劃痕實驗又稱傷口愈合實驗，是檢測細胞遷移的一種方法。細胞能感受到“傷口”，并通過重組微管組織中心沿垂直于傷口劃痕的方向運動[17]。對于抗腫瘤藥物來說，抑制細胞遷移能力越強，表明其抗腫瘤效果越好。實驗結果發現夏枯草醇沉淀物與醇溶解物抑制腫瘤細胞遷移能力與濃度呈正相關，濃度越高，抑制效果越強，且不同細胞間抑制效果不同，兩種醇提物對A549細胞的抑制遷移效果較HepG2細胞好，同一濃度醇溶解物抑制HepG2細胞的遷移作用較醇沉淀物強，Hwang等[18]研究也證實夏枯草乙醇提取物比水溶解部分的抗氧化效果和抗腫瘤效果更強。實驗中發現一個矛盾的現象,在0.05～0.1g/ml濃度范圍內，醇溶解物抑制細胞遷移能力與抑制細胞增殖能力不一致，高濃度組未出現細胞遷移，但是細胞狀態較低濃度組好，0.1g/ml濃度組雖然出現細胞遷移現象，但細胞出現圓縮，細胞數量顯著減少，這一結果表明醇溶解物高濃度時通過抑制細胞遷移較抑制細胞增殖發揮抗腫瘤效果作用強，到0.1g/ml時則反之。這對于患者抗腫瘤用藥就是一個福音，因為在這個濃度范圍內夏枯草醇溶解物一直能發揮很好的抗腫瘤效果。

綜合細胞增殖實驗和細胞劃痕實驗結果，筆者發現醇沉淀物各濃度抗腫瘤效果呈濃度依賴性，濃度越高，通過抑制腫瘤細胞增殖和抑制腫瘤細胞遷移的效果越強。醇溶物MTT結果顯示在一定范圍內對A549細胞和HepG2細胞的增殖呈“V”字型的抑制作用。