豁痰化瘀利水方對急性硬膜下血腫大鼠腦組織MCP-1、NF-κB的影響

蔡清風 劉正敏 李 燁 胡小銘 劉補興 童軍衛

急性硬膜下血腫(acute subdural hematoma，ASDH)是由于大腦橋靜脈斷裂使得血液聚集于硬膜下腔而形成的一種顱腦損傷并發癥，患者臨床常出現顱內高壓、腦水腫而表現為失語、偏癱、昏迷等癥狀，其致殘率高、病死率高，嚴重威脅患者生命健康[1]。研究發現，顱內高壓、腦水腫多由非感染性炎性反應引起，而單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、核因子-κB(NF-κB)在炎癥發生過程中起著重要作用[2，3]。目前，臨床多通過手術治療ASDH患者，但手術病死率居高不下[4]。研究顯示，中醫藥治療ASDH能有效降低炎性反應，療效顯著[5]。由此，本研究通過建立成年大鼠ASDH模型，以探究分析豁痰化瘀利水方對ASDH大鼠腦組織MCP-1、NF-κB的影響，現報道如下。

材料與方法

1.材料與試劑：所有健康成年SD大鼠由筆者醫院動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(浙)2016-0019；豁痰化瘀利水方各中藥成分均購自臺州中醫大藥房；天丹通絡膠囊(規格0.4克/粒；批號：20150204)購自山東鳳凰制藥股份有限公司；DAB顯色試劑盒(規格：100ml，批號：DA1015)購自北京索萊寶科技有限公司；羊抗大鼠MCP-1(批號：sc-130328)及兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；Trizol一步法試劑盒及RT-PCR定量引物均購自美國Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒及相關酶類均購自日本TaKaRa公司；免疫印跡ECL發光試劑盒(規格：100ml，批號：E002050)購自上海碩嘉生物科技有限公司。

2.動物處理及分組：選取健康成年SD大鼠152只，雌雄各半，3月齡，體質量250±20g，按數字表法將其隨機分為4組，每組各38只；(1)模型組：即ASDH組，鉆孔注血，以灌胃方式給予該組2ml蒸餾水。(2)假手術組：即Sham組，只鉆孔不注血，以灌胃方式給予該組2ml蒸餾水。(3)陽性對照組：以灌胃方式給予ASDH大鼠2ml天丹通絡膠囊治療，0.54g/kg，1次/天。(4)觀察組：以灌胃方式該組給予ASDH大鼠2ml豁痰化瘀利水方低劑量、中劑量、高劑量治療，濃度分別為14.13、28.26、56.52g/kg，1次/天；以上處理均持續14天。

3.藥物制備：豁痰化瘀利水方由20g丹參、15g當歸、15g川芍、15g水蛭、15g地龍、10g膽南星、6g天竺黃等中藥材組成，加水600ml，室溫浸泡30min，常規煎煮至200ml，過濾藥液后并在藥渣中重新加水300ml，常規煎煮至200ml，經再次過濾后棄渣保留濾液，合并2次過濾藥液，將其加熱濃縮，后續分別將其濃度稀釋至實驗所需濃度。將天丹通絡膠囊藥物活性成分研磨后溶于水中。

4.ASDH造模：依據Yokobori等[6]的造模方法，并稍加改良以復制ASDH模型，具體操作如下：所有SD大鼠均給予3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后SD大鼠取俯臥位并將其頭部固定于腦立體定向儀上，頭部剃毛后給予常規消毒，沿頭頂部正中線切開1個長約0.5cm的切口，偏右側剝離骨膜以露出矢狀縫與冠狀縫，采用楔形高速鉆頭在矢狀縫右側3mm及冠狀縫后側2mm處開1個直徑0.9mm的骨窗孔(注意避免破壞硬膜)，取自體股靜脈血500μl通過骨窗孔以50μl/s的速度注入硬膜下腔隙(注意避免破壞蛛網膜)，待血液凝固后拔出針頭，封閉骨窗孔并縫合頭皮，連續3天注射青霉素以防止感染，通過剝離腦組織觀察注血側血腫情況已證實ASDH造模成功。

5.ASDH模型腦組織血腫觀察：處理14天后，每組隨機取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，迅速剝離腦組織觀察各組血腫大小，以ASDH造模后第3天大鼠腦組織血腫面積為對照1(即100%)，分析各組處理后急性硬膜下血腫消散情況。

6.腦組織免疫組化分析：處理14天后，每組隨機取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，取注血側腦組織于液氮中冷凍10s，之后用冰凍組織切片包埋劑(OTC)包埋腦組織，通過冰凍切片機獲得4μm厚的冠狀位連續切片，將腦組織切片置于10%甲醛溶液于4℃下固定過夜，經脫蠟、脫水等處理后，可通過DAB顯色試劑盒進行MCP-1、NF-κB免疫組織化學染色。陽性細胞表達為棕黃色，在光學顯微鏡下每只大鼠腦切片隨機選取5個不連續視野(放大倍數×400)，依據視野中陽性細胞表達比例表示該切片MCP-1、NF-κB的表達情況。

7.腦組織MCP-1及NF-κB mRNA水平檢測：處理14天后，每組隨機取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，取注血側腦組織100mg，采用Trizol一步法試劑盒提取大鼠腦組織總RNA，保證總RNA的濃度、純度及完整性，通過RNA反轉錄試劑盒獲取模板cDNA，將模板稀釋至100ng/μl，采用RT-PCR試劑盒分別以MCP-1、NF-κB及內參基因β-actin定量引物(引物序列見表1)，在RT-PCR儀上(廠家：Bio-Rad；型號：CFX96)進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)，反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s；55℃退火25s；72℃延伸20s，40個循環；72℃延伸5min。數據讀取由實時熒光定量PCR儀自動完成，供試基因的擴增效率均在85%以上。基因MCP-1、NF-κB及β-actin表達水平計算采用2-ΔΔCt方法，詳見表1。

8. 腦組織MCP-1及NF-κB蛋白水平檢測：處理14天后，每組隨機取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛進行麻醉，完全麻醉后切斷大鼠頭顱，從注血側腦組織中提取總蛋白。將腦組織用1×PBS緩沖液漂洗2次，之后置于含1mmol/L PMSF的RIPA細胞裂解液中進行勻漿，經低溫離心機以12000r/min轉速離心10min后分離上清液，加入2×PBS上樣緩沖液，經沸水浴變性10min，通過10%的SD-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，將分離蛋白轉移至PVDF膜，經5%脫脂奶粉于4℃下封閉1h，并用一抗兔抗大鼠MCP-1、NF-κB及β-Actin多克隆抗體以1∶500比例于4℃下孵育過夜，之后再將HPP結合的二抗以1∶5000比例與膜于室溫下孵育1h，通過免疫印跡ECL發光試劑盒檢測大鼠腦組織MCP-1、NF-κB蛋白表達水平。

表1 基因MCP-1及NF-κB引物序列

結 果

1.急性硬膜下血腫消散情況比較：與ASDH模型組比較，其余各組血腫面積均顯著降低，詳見表2。低劑量組大鼠腦組織血腫消散改善情況低于陽性對照組(P<0.01)，中、高劑量組均高于陽性對照組(P<0.01)，且高劑量組顯著高于中劑量組(P<0.01)。對各腦組織組血腫面積定量分析發現，與ASDH模型組比較，各組血腫面積均顯著降低(P<0.01)，詳見圖1、圖2；低劑量組明顯高于陽性對照組

表2 不同組急性硬膜下血腫面積比較

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與陽性對照組比較，#P<0.01；與低劑量組比較，ΔP<0.01；與中劑量組比較，▲P<0.01

(P<0.01)，中、高劑量組血腫面積顯著低于陽性對照組(P<0.01)，且高劑量組低于中劑量組(P<0.01)，詳見圖3。

圖1 不同組急性硬膜下血腫消散情況

圖2 不同組血腫消散情況

圖3 不同組血腫面積比較與ASDH模型組比較，*P<0.01；與陽性對照組比較，#P<0.01；與低劑量組比較，ΔP<0.01；與中劑量組比較，▲P<0.01

2.免疫組化分析：各組中均觀察到腦組織細胞質中MCP-1、NF-κB蛋白陽性表達，Sham組MCP-1、NF-κB蛋白有弱陽性表達，而ASDH模型組MCP-1、NF-κB蛋白強陽性表達，詳見表3、圖4及圖6。與ASDH模型組比較，其他組陽性細胞表達均顯著降低(P<0.01；與陽性對照組比較，觀察組中劑量、高劑量組陽性細胞表達顯著降低(P<0.01)，而低劑量組陽性細胞表達顯著升高(P<0.01)；與中劑量比較，高劑量組陽性細胞表達顯著降低(P<0.01)，詳見表3、圖5及圖7。

表3 不同組陽性細胞表達情況比較

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量比較，&P<0.01

圖4 MCP-1蛋白表達染色情況

圖5 MCP-1陽性細胞表達比例與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖6 NF-κB蛋白表達染色情況

圖7 NF-κB陽性細胞表達比例與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

3.MCP-1及NF-κB mRNA水平：各組總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳圖，詳見圖8；與ASDH模型組比較，其他組MCP-1、NF-κB mRNA相對表達水平均顯著降低(P<0.01)；與陽性對照組比較，中劑量、高劑量組MCP-1、NF-κB mRNA相對表達水平均顯著降低(P<0.01)，低劑量組水平均顯著升高(P<0.01)；與中劑量比較，高劑量組MCP-1、NF-κB mRNA相對表達水平均顯著降低(P<0.01)，詳見表4、圖9及圖10。

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖8 各組總RNA瓊脂糖凝膠電泳

圖9 MCP-1 mRNA相對表達水平，以ASDH模型表達水平為對照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖10 NF-κB mRNA相對表達水平，以ASDH模型表達水平為對照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

4.MCP-1及NF-κB蛋白水平：各組蛋白電泳圖見圖11。與ASDH模型組比較，其他組MCP-1、NF-κB mRNA相對表達水平均顯著降低(P<0.01)；與陽性對照組比較，中、高劑量組MCP-1、NF-κB蛋白相對表達水平均顯著降低(P<0.01)，而低劑量組均顯著升高(P<0.01)；與中劑量比較，高劑量組MCP-1、NF-κB mRNA相對表達水平均顯著降低(P<0.01)，詳見表5、圖12及13。

表5 不同組MCP-1、NF-κB蛋白相對表達水平

與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖11 MCP-1、NF-κB蛋白免疫印跡電泳條帶

圖12 MCP-1蛋白相對表達水平，以β-actin內參蛋白為對照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

圖13 NF-κB蛋白相對表達水平，以β-actin內參蛋白為對照與ASDH模型組比較，*P<0.01；與Sham組比較，#P<0.01；與陽性對照組比較，ΔP<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.01；與中劑量組比較，&P<0.01

討 論

本研究基于Yokobori等[6]的造模方法并加以改良后獲得了穩定、高效的大鼠急性硬膜下血腫模型(ASDH)，通過剝離腦組織觀察注血側血腫情況已證實ASDH造模成功。為確定正常情況及治療處理后血腫消散情況，本研究分析統計各組血腫面積，結果表明正常情況下ASDH模型14天后存在部分血腫自然消散情況，而其他組血腫面積均顯著低于ASDH模型組；處理后觀察組中劑量及高劑量組血腫面積均顯著低于陽性對照組，而觀察組低劑量組血腫面積顯著高于陽性對照組，提示豁痰化瘀利水方具有促進血腦屏障恢復，減輕腦水腫的作用，且與劑量有關，劑量越高其效果越顯著。

有關研究表明，急性硬膜下血腫發生后，其血腫周圍組織可刺激誘導多種炎性細胞因子聚集，并引發機體炎性反應，進而加劇腦損傷[7，8]。MCP-1屬于CC趨化因子家族，是一種促炎細胞因子，可在神經元細胞、神經膠質細胞等的神經組織中表達，腦血腫損傷能夠特異性激活并趨化單核-吞噬細胞參與炎性反應，而活化的神經膠質細胞可產生大量神經毒性因子，在腦損傷、神經炎癥等多種疾病中具有重要作用[9，10]；MCP-1可通過單核-吞噬細胞浸潤誘導釋放炎性細胞因子及在腦損傷區域聚集白細胞而加劇血腫炎性反應[11]。研究顯示，ASDH等疾病發生時MCP-1水平呈高表達，病情好轉時，MCP-水平顯著降低[12]。本研究結果表明，與ASDH模型組比較，其他組血腫面積、MCP-1陽性細胞表達比例、mRNA相對表達水平及蛋白水平均顯著降低，且效果與豁痰化瘀利水方劑量呈依賴關系，認為豁痰化瘀利水方更能有效減少硬膜下血腫面積，豁痰化瘀利水方可能通過抑制織MCP-1表達，抑制炎性通路活化，減輕炎性反應，減輕腦水腫，并促進血腫的消散。此結果與有關研究一致，進一步表明豁痰化瘀利水方對改善ASDH具有一定的作用。

NF-κB是一種核轉錄調控因子，經刺激活化后能夠調控多種細胞因子、趨化因子等蛋白合成，并促使釋放大量炎性細胞因子，參與ASDH引起的炎性反應網絡，產生的炎性瀑布反應可進一步引起繼發性腦損傷[13]；NF-κB在腦損傷中同時具有雙重作用，可促進炎性反應引起神經損傷，同時對神經系統起到保護作用[14]。還有研究認為，NF-κB是調節腦損傷后炎性反應的重要靶點，其不僅可介導多種炎性因子的表達，也是調節腦損傷后炎性反應的重要信號調控因子[15,16]。有關研究認為，化瘀滌痰湯對急性硬膜下血腫大鼠腦組織NF-κB介導的炎性反應具有調節作用，且對ASDH大鼠也有明顯的治療作用[16]。

本研究結果顯示，不同組 NF-κB mRNA及蛋白水平比較差異有統計學意義，隨著豁痰化瘀利水方劑量升高， NF-κB mRNA及蛋白水平呈現下降的趨勢，且效果與劑量呈依賴關系，表明NF-κB與ASDH的發生密切相關，而豁痰化瘀利水方能夠通過降低NF-κB的表達而達到改善ASDH，推測其作用可能是通過調節NF-κB的平衡而實現的。可能是本方劑中含有丹參、當歸、水蛭等藥物，丹參能夠抑制NF-κB的表達與活性，使多種炎性因子基因轉錄減少，減少炎性遞質釋放，緩解炎性因子損傷及氧化應激反應；而當歸具有增強免疫力、抗炎、清除自由基、抗血栓形成及改善血液循環等作用，當歸能夠降低氧化自由基對NF-κB的活化引起的炎性反應，諸藥合用對ASDH發揮較好的改善作用。

綜上所述，豁痰化瘀利水方能夠有效減少急性硬膜下血腫面積，降低腦組織中MCP-1、NF-κB的表達，其效果與豁痰化瘀利水方劑量關系密切，值得后期進一步擴大樣本量、增加腦損傷指標等進行深入研究，以期為急性硬膜下血腫患者的治療提供一定參考依據。