HPIP在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義

王海璐 田淞宇 陳秀瑋 王榆平 侯思宇

子宮內膜癌是發生于子宮內膜上皮的惡性腫瘤，最常見為子宮內膜腺體來源，是女性生殖類三大惡性腫瘤之一，其發病率約占女性全身惡性腫瘤的7%，約占女性生殖道腫瘤的20%～30%，居女性生殖道惡性腫瘤的第四位[1]。子宮內膜癌的發生率呈逐年上升并有年輕化的趨勢[2]。每年增加2.4%，死亡率增加了1.9%，5年和10年的相對存活率分別是82%和79%[3-5]。子宮內膜癌的診刮為盲刮，對于較小的病灶容易出現漏診，有文獻報導這種盲刮的漏診率可達35%[6]，即使有經驗的專家刮診時也有10%～25%的宮腔疾病被漏診，尤其是宮底、宮角等特殊部位[7]。子宮內膜癌死亡率較高，仍然是1個相對嚴重的問題，確定子宮內膜癌的有效生物學標志，對于內膜癌患者提供早期診斷和提供靶向治療，發現特異性生物學標志，可以有效預測子宮內膜癌的預后及發展，值得我們去重視。

1 材料與方法

1.1 對象和選取組織

選取2011年1月至2012年1月在哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院收治的80例診斷為EC患者的包埋病理組織樣本，。所有EC患者術前沒有接受任何放化療。內膜癌手術范圍包括次廣泛全子宮切除+雙附近切除術+盆腔淋巴結清掃術。手術切除后行病理檢查，判斷組織學類型，細胞分級，基層浸潤深度，脈管轉移和淋巴結轉移。所有研究患者手術病理分期和組織學分期基于2009年國際婦產科聯盟(Federation international of gynecology and obstetrics,FIGO)。另取2016年1月至2017年1月婦科手術切除或刮宮的子宮內膜標本，正常子宮內膜組織10例，臨床資料及病理資料收集完整。

1.2 試劑與方法

Anti-PBXIPI antibody(ab84752),購自Abcam公司。PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組化常規試劑：PBS緩沖液，氯化鈉，二甲苯，酒精，碳酸氫二鈉過氧化氫，蘇木精，蒸餾水等均由哈醫大形態中心提供。

1.3 免疫組織化學

標本采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化染色法來研究HPIP在EC和正常內膜組織中的表達。①切片：對采集的組織蠟塊連續切片，在溫水中展開，用載玻片撈取組織切片；②脫蠟、水化：置入60 ℃恒溫箱中預熱20 min，依次浸入二甲苯(10 min 2次)、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min；③洗片：用蒸餾水沖洗5 min，用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；④阻斷內源性過氧化物酶：組織玻璃片浸入3%過氧化氫中15 min，用PBS沖洗3次；⑤抗原修復：將組織置入抗原修復盒中，倒入0.01 mol/l枸櫞酸鈉緩沖液(PH6)，在高壓鍋內沸水加熱4 min，冷卻至常溫，PBS緩沖沖洗液3次；⑥滴加一抗體：每張切片滴加HPIP多克隆抗體(稀釋比例1∶200)完全覆蓋組織，陰性加蒸餾水，鋪于孵育濕盒在4 ℃的冰箱中過夜，PBS緩沖液洗沖3次，每次3 min；⑦滴加二抗體：用濾紙去除多余的PBS緩沖液，滴加PV山羊抗兔IgG/HRP聚合物，平鋪于濕盒中，室溫孵育30 min，PBS緩沖液3次，每次3 min；⑧DAB染色：新配置的DAB染色劑，滴加在每張玻片上，置于顯微鏡顯色情況，顯微鏡觀察確定反應終止時間，蒸餾水沖洗干凈；⑨蘇木精復染：蘇木精復染1～2 min，用蒸餾水沖洗干凈，在顯微鏡下染色滿意后，依次75%乙醇(5 min，1次)、85%乙醇(5 min，1次)、95%乙醇(5 min，1次)，100%乙醇(10 min，2次)，脫水干燥，中性樹膠封片，置入80 ℃恒溫烤箱內烤干。

1.4 實驗結果評價標準

全部染色組織切片由哈爾濱醫科大學病理學專家在雙盲法下獨立判斷。染色程度評分：0分(無染色)、1分(弱染色)、2分(中度染色)、3分(強染色)。表達強度：0分(0%～5%陽性細胞)、1分(5%～25%陽性細胞)、2分(26%～50%陽性細胞)、3分(51%～75%陽性細胞)、4分(>75%陽性細胞)。最終評分相乘。

1.5 統計學分析

統計學分析數據應用SPSS 22.0統計學軟件進行統計分析，正常組織HPIP蛋白的表達和EC中HPIP的表達存在明顯差異，EC患者的HPIP蛋白表達與臨床病理資料的關系應用卡方檢驗。P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 HPIP蛋白在正常內膜組織和EC組織中表達情況

免疫組化實驗顯示：HPIP在正常內膜組織和EC中的表達陽性顆粒都分布在胞質中，呈棕黃色。經過統計學的分析，正常內膜組織中的HPIP陽性表達率為10%(1/10)。EC組織中HPIP陽性率73.7%(59/80)。兩者的表達情況具有統計學意義。

2.2 HPIP表達與EC臨床病理特征的關系

HPIP蛋白在EC組織中的表達與患者年齡、腫瘤浸潤深度和腫瘤脈管浸潤無顯著關系(P>0.05)，但是與手術病理FIGO分期、組織學分級、淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)，見表1。

表1 HPIP在EC中的表達與臨床病理特征的關系/例

3 討論

HPIP蛋白也稱前B細胞轉錄因子相互作用蛋白[8]，該蛋白既是1種核質穿梭蛋白也是1種微管結合蛋白[9]，隨著對HPIP細胞研究的不斷深入，發現造血前B細胞白血病轉錄因子(PBX)相互作用蛋白(HPIP/PBXIP1)在癌癥的侵襲和轉移中起著重要的作用。證據顯示HPIP與腫瘤關系極其密切，具有一定的癌基因特性，它在許多人類惡性腫瘤中呈現高表達狀態，如乳腺浸潤性導管癌[10]、肝癌[11]、胃癌[12]、口腔癌[13]、結直腸癌[14]，并且在腫瘤的發生、遷移、侵襲和轉移中起著重要作用。與惡性腫瘤相比，HPIP蛋白在正常子宮內膜組織中是否存在差異性表達，從而確定其與子宮內膜癌的發生和發展有關。研究HPIP蛋白與子宮內膜癌的分級、分期、淋巴結轉移、浸潤深度、及患者的發病年齡等的相關性，從而確定其高表達可能促進子宮內膜癌的發生、發展。HPIP可能惡性腫瘤精準治療的新突破[7]。

影響子宮內膜癌患者臨床復發及其預后的危險因素主要有淋巴血管間隙浸潤、子宮腔受累范圍、基層浸潤深度以及組織學分級[15]。其組織學分化越低，肌層浸潤越深，盆腔淋巴結轉移較多，其預后越差。研究表明，高、中、低分化的5年生存率分別為94%、84%、72%[16]。影響EC患者預后已知因素包括患者年齡、FIGO分期、組織學分級及手術治療效果等。因此有必要對其免疫機制進行研究，旨在研究HPIP蛋白在子宮內膜癌中的表達意義。

本研究表明，HPIP蛋白高表達與腫瘤進展有密切的關系。HPIP可以作為EC進展及預后的1個獨立的生物學標志。我們研究HPIP蛋白在EC的表達與其臨床病理特征的相關性。我們采用免疫組化實驗方法，觀察EC組織和正常子宮內膜組織的HPIP蛋白的表達情況，實驗數據統計分析顯示HPIP蛋白高表達與EC臨床分期、組織學分級、淋巴結轉移顯著相關。這些結果都表明HPIP蛋白在EC的發展中起著至關重要的作用，我們所研究的結果與之前HPIP蛋白在這種癌癥中對于腫瘤發展的研究結果一致[2,17-18]。研究發現HPIP蛋白的表達在腫瘤的發生、發展中起著十分重要的生物學作用。

到目前的研究為止，一些研究可以解釋HPIP蛋白促進腫瘤發生發展的機制，HPIP高表達導致某些癌基因的活化，例如細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B、細胞周期蛋白D1[14]、而且最近證明HPIP蛋白在信號轉導途徑中起關鍵的作用,從而促進腫瘤細胞增殖。WANG等研究表明HPIP蛋白在P13K/ART信號轉導中起著重要的作用，其調節多種生物學行為，例如細胞凋亡，腫瘤發生，細胞上皮間質轉化[19]。一些研究也證明，HPIP蛋白可以在幾種癌細胞中介導特異性雌激素受體信號的傳導。FENG等推測HPIP蛋白可以激活結直腸癌細胞中MAPK/ERK通路，從而促進腫瘤的增殖和遷移[12]。這些研究提供了重要的信息，都可以證明HPIP蛋白在促進癌癥的發生和腫瘤的發展的機制，HPIP高表達的患者有較差的預后。

HPIP蛋白抑制鱗狀上皮細胞癌抗原9細胞系(SCC9)的分化和增殖，同時抑制質形成細胞系(NHEK)的碳酸脂質的遷移[13]。在體外敲出HPIP蛋白可以抑制癌細胞的生長在炎癥浸潤細胞中，HPIP蛋白的表達呈陽性[20]。在口腔鱗狀細胞癌前病變組織中HPIP蛋白表達陽性細胞的數量明顯高于Ki-67表達陽性的細胞數量，HPIP蛋白表達陽性細胞所在的區域被認為上皮細胞結構受到明顯干擾。HPIP蛋白可能將應用于口腔癌抗癌療法的潛在靶標[13]。有研究表明，HPIP蛋白促進腫瘤細胞遷移和侵襲，通過激活MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信號通路來促進結直腸腫瘤細胞的增殖、遷移和上皮間質轉換[12]，HPIP蛋白抑制結直腸癌細胞的凋亡，BCL2是HPIP調節細胞凋亡的關鍵。LY294002或PD98059治療結直腸癌的機制是通過抑制AKT和ERK1/2信號蛋白的磷酸化，從而調節結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[12]。

本實驗主要研究HPIP蛋白促進EC的發生、發展。此研究不足是研究的病例數量少，因此需要1個大的樣本研究設計，結果會更加信服。進一步研究HPIP在EC中的作用，并且研究其作用通路及機制，確定HPIP是否結合其他信號蛋白改善EC患者預后。