瘦素對人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖、遷移及侵襲的影響

王 帥 葛俊杰 耿 曉 崔 文 周成軍

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，發生率近10年顯著增高。甲狀腺乳頭狀癌在甲狀腺癌中最為常見，占80%～85%[1]。流行病學調查顯示，肥胖是惡性腫瘤發生的危險因素。有學者對肥胖與甲狀腺癌的關系進行了研究，結果顯示在肥胖人群中甲狀腺癌發生率更高[2]。并有研究報道血清瘦素水平與體重呈正相關[3]。瘦素是研究最多的脂肪因子之一，是由肥胖基因(ob)編碼的蛋白類激素。可以通過調節體內脂肪儲存來調節體重，并且對于食物攝取與能量平衡、新陳代謝、神經內分泌也有調節作用[4]。本研究對瘦素與人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞的關系進行實驗，研究瘦素對K1細胞功能的調控。

材料與方法

1.材料 ：人甲狀腺乳頭狀癌細胞系(K1)購于歐洲細胞庫(英國ECACC公司)。DMEM培養基購自中國Fisher公司，胎牛血清(FCS)購自杭州四季青公司，MTT購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國Costar公司。

2.方法：(1)細胞培養使用含有10%胎牛血清DMEM培養基，將培養瓶放于37℃、5% CO2培養箱中培養。在倒置顯微鏡下觀察細胞融合至80%時，1∶2傳代。(2)MTT實驗:取對數生長期的K1細胞，按5×103個/孔接種于96孔板中。接種第2天換DMEM無血清培養液，每孔加入100μl。第3天同一時間，配置好不同濃度的瘦素，實驗設置0ng/ml(空白對照組)、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、125ng/ml 5個組，每組設置3個復孔。分別在加藥后的24h和48h加入25μl MTT溶液，2h后加入100μl Lysis buffer溶液，過夜(超過12h)后測吸光度值(波長為570nm)，以上實驗重復3次，取平均值。(3)劃痕實驗:將K1細胞以每孔1×106個細胞接種于6孔板中。第2天長滿后用200μl的槍頭比對直尺垂直劃痕。每孔劃痕3道垂直線。劃痕后使用PBS沖洗細胞2次。用配制好的不同濃度瘦素給予刺激(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、125ng/ml)。分別在0、24和48h置于熒光倒置顯微鏡下拍照。計算得出細胞遷移率[細胞遷移率(%)=(修復前劃痕內面面積-修復后劃痕內面面積)/修復前劃痕內面面積×100%]。以上實驗重復3次，取平均值。(4)Transwell實驗:用30μl 1∶6稀釋的Matrigel膠鋪于Transwell小室上層，2h后加100μl DMEM培養基水化，上室加入用不同濃度瘦素預先處理過的細胞2×105個，下室加入500μl含10%FBS的培養基，每組設3個復孔。放置培養箱中培養72h。72h后取出小室，PBS清洗3遍，棉簽輕輕擦去上室內細胞，無水甲醇固定30min，0.5%的結晶紫染色30min，PBS清洗3次，自然風干，每個濃度組在正置顯微鏡下取5個視野拍照。以上實驗重復3次，取平均值。

結 果

1.MTT實驗檢測K1細胞增殖：5組不同濃度瘦素處理K1細胞后，用MTT法連續觀察K1細胞在24h和48h增殖情況，檢測波長570nm處的吸光度(A)值，運用ANOVA法計算出數據(表1)。結果顯示相同時間下不同波度組的瘦素對K1細胞的增殖并無影響，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 不同濃度瘦素影響K1細胞增殖

2.劃痕實驗檢測K1細胞遷移：0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和125ng/ml不同濃度瘦素組24h K1細胞遷移率分別為40.201%、47.383%、59.950%、68.732%、79.306%；48h細胞遷移率分別為49.398%、74.192%、86.733%、87.795%、90.005%。隨著瘦素濃度逐漸升高，劃痕內面面積縮小，遷移率升高；隨著瘦素處理時間延長，劃痕內面面積縮小，遷移率升高。K1細胞表現出與瘦素的時間依賴性與濃度依賴性的特點。24h與48h遷移率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各濃度瘦素處理K1細胞后遷移率分析(%)

3.Transwell實驗檢測K1細胞侵襲：顯微鏡下計數0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和125ng/ml 5個濃度組的K1細胞穿出聚碳酸酯膜個數分別為63±3、97±7、126±6、140±1、180±2個(圖2)。穿出聚碳酸酯膜的細胞個數與瘦素濃度呈正比。隨著瘦素濃度增加，K1細胞侵襲能力增強，說明瘦素對K1細胞侵襲能力有促進作用，差異有統計學意義(P=0.000)。

圖1 各濃度瘦素處理K1細胞后劃痕實驗圖片(×100，熒光倒置顯微鏡)

圖2 不同濃度瘦素處理K1細胞侵襲性比較(結晶紫染色，×100)A.0ng/ml;B.10ng/ml;C.50ng/ml;D.100ng/ml;E.125ng/ml

甲狀腺癌是目前增長最快的惡性腫瘤，排名第6位[5, 6]。甲狀腺癌有4種分型，即甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、濾泡型甲狀腺癌(FTC)、低分化癌(PDTC)和未分化癌(ATC)。2014年美國診斷病例為62980例，其中90%為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[7]。未分化的甲狀腺癌由于遠處轉移和缺乏有效治療，10年生存率<10%[8]。隨著多種診斷技術和診斷方法的增加，甲狀腺癌的檢出率也逐漸增高，甲狀腺癌早期多無明顯癥狀，多在健康體檢中發現有占位性病變。另外CT、MRI掃描、生化標志物等多種診斷技術的使用增多也使甲狀腺癌的檢出率增高[9]。

根據流行病學調查顯示，肥胖已經成為全球性疾病，并且與許多疾病息息相關，也是致癌的危險因素之一。脂肪組織不僅可以儲存能量，還能分泌細胞因子和激素，如脂聯素(adiponectin)、瘦素(leptin)、內臟脂肪素(visfatin)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。雖然與肥胖發生的相關分子機制尚未完全明確，但是基因起到決定性因素，最主要的基因是肥胖(Ob)基因和Ob受體(Ob-R)基因。瘦素與其受體結合后激活PI3K、ERK1/2、STAT3條通路，從而促進腫瘤細胞的增殖，并且當瘦素受體相對缺乏時，可影響ERK1/2和(JAK2)/ STAT3信號轉導[10，11]。

瘦素是由Ob基因編碼的由167個氨基酸組成的蛋白質入血后去除N末端的21個氨基酸信號序列后，形成含有146個氨基酸的蛋白類激素[12]。大多數瘦素主要分布在白色脂肪，血循環中瘦素濃度測定直接與人體白色脂肪的總量呈正比。健康人群中瘦素的含量是5～10ng/ml,肥胖人群中瘦素含量是40～100ng/ml[13]。

Rehem等[14]研究了高分化甲狀腺癌與血清瘦素的關系，采集30例高分化甲狀腺癌患者與30例甲狀腺良性結節患者術前和術后1個月的血樣，分析血清瘦素的變化，得出血清瘦素水平比對照組高且術后下降，這一現象說明瘦素在診斷甲狀腺癌中起到重要作用。Hedayati等[15]選取83例甲狀腺乳頭狀癌PTC患者(35例男性、48例女性)和90名健康者(40名男性、50名女性)，年齡、性別、BMI均互相匹配。采集血樣測定血清瘦素后比較含量，并測量身高、體重、計算BMI。實驗分析患病組比正常組血清瘦素水平高，說明瘦素與PTC有相關性；女性比男性瘦素水平高，說明體內的脂肪含量與瘦素水平呈正比(女性體內脂肪含量高于男性)。Fan等[16]探討了瘦素及其受體在甲狀腺癌預后中的潛在意義，選取173例甲狀腺癌患者，得出瘦素及其受體的表達與PTC有相關性，并且會引起患者預后不良。

本實驗選取了脂肪因子中的瘦素進行細胞實驗，MTT實驗結果顯示瘦素并不影響細胞的增殖(P>0.05)。體內的腫瘤細胞能夠大量增殖可能與癌細胞遠處轉移這一特性有關，從而促進了癌細胞的大量增殖[17]。在本實驗中癌細胞增殖不受影響，或許是因為細胞模型的局限性所致。另外的一個原因或許是因為瘦素抵抗現象，即瘦素受體具有飽和性，從而導致濃度過高的瘦素因為瘦素受體的這一特性不能完全發揮作用。也或許是瘦素僅僅是在患癌的起始階段起了一定的作用，體內過高濃度的瘦素只起到致癌的作用，而并不能促進癌細胞生長。中國臺北地區Mackay Memorial醫院的Cheng等[17]研究了瘦素對K1細胞的遷移能力，研究發現高濃度瘦素能夠提高其遷移性[17]。本實驗用不同濃度的瘦素處理K1細胞后劃痕實驗也得出瘦素能夠促進K1細胞的遷移。腫瘤細胞穿過基膜是腫瘤細胞是否轉移的關鍵一步，建立體外侵襲實驗的細胞模型模擬腫瘤細胞在體內侵襲的生理過程，本實驗結果顯示瘦素促進甲狀腺癌細胞的侵襲，并且隨瘦素濃度的增加侵襲性增強。本實驗初步探討了瘦素對于甲狀腺癌侵襲的影響，機制還尚不完全清楚，在下一步實驗中還需進一步研究哪個信號通路在這一過程中起作用。

綜上所述，對甲狀腺癌的診斷除其他的特定腫瘤標志物外，瘦素還可作為一個相關肽輔助診斷。在臨床甲狀腺癌治療中，瘦素或許可以作為一個基因治療的靶點或是一種新藥起到臨床治療作用。