脊肌萎縮癥治療研究進(jìn)展

呂亞豐 張艷君 程謨斌 劉子瑾 董文吉 張 業(yè)

脊肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是一種單基因常染色體隱性遺傳疾病，主要是由于SMN1基因的純合子缺失而導(dǎo)致，其特征是脊髓前角細(xì)胞變性和由此引起的肌肉萎縮和無力，該疾病發(fā)生率為1/6000～10000，攜帶率為1/40～50，是導(dǎo)致嬰兒死亡的最主要遺傳病。SMA的治療主要分為優(yōu)化臨床管理和藥物治療兩個(gè)方面，但目前沒有藥物能夠有效治療SMA，盡管如此，在過去20多年累積的對(duì)SMA分子遺傳學(xué)和病理生理學(xué)的認(rèn)識(shí)，為藥物的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，也為迎來轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的新時(shí)代做好了準(zhǔn)備。

一、脊肌萎縮癥發(fā)病的分子機(jī)制

該疾病由Werdnig于1891年首次報(bào)道[1]。1995年Melki 實(shí)驗(yàn)室克隆并鑒定該病的致病基因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(survival motor neuron 1，SMN1)[2]，人類SMN基因位于5q13，分為SMN1和SMN2，SMN1基因位于端粒側(cè)，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生全長mRNA，編碼全長為294個(gè)氨基酸的SMN蛋白質(zhì)，SMN2基因位于著絲粒側(cè)，SMN2基因與SMN1基因在外顯剪接增強(qiáng)子處有一個(gè)核苷酸的差異，從而使得轉(zhuǎn)錄后的SMN2缺失第7個(gè)外顯子，編碼截?cái)嗟腟MN蛋白，截?cái)嗟腟MN蛋白喪失全長SMN蛋白的功能，并且在細(xì)胞內(nèi)迅速降解。有趣的是，SMN2 mRNA的第7個(gè)外顯子在有些情況下并不是全部缺失，SMN2基因仍然能夠產(chǎn)生一小部分(10%～15%)全長mRNA，這部分mRNA可編碼具有正常功能的SMN蛋白(圖1)。

研究發(fā)現(xiàn)95%的SMA是由于SMN1基因的純合子缺失而引起，SMA患者體內(nèi)由于SMN1基因的缺失，不能產(chǎn)生足夠的SMN蛋白。在疾病狀態(tài)下，體內(nèi)SMN蛋白主要來源于SMN2基因，由于SMN2基因只有少部分可產(chǎn)生功能性SMN蛋白，因此SMA主要是由于體內(nèi)SMN蛋白的缺乏而引起。SMA患者中SMN2基因的拷貝數(shù)差異較大，表型分析發(fā)現(xiàn)一般情況下SMN2基因的拷貝數(shù)與疾病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，雖然SMN2基因的拷貝數(shù)是SMA疾病嚴(yán)重程度的最主要決定因素，但不是唯一因素。Prior 等[4]在3例3型SMA患者中發(fā)現(xiàn)其SMN2僅有2個(gè)拷貝，這些患者SMN2基因的第7個(gè)外顯子有一個(gè)核苷酸的突變，即c.859G>C，突變后形成一個(gè)外顯剪接增強(qiáng)子元件，從而產(chǎn)生了更多的全長SMN蛋白及較輕的臨床表現(xiàn)。因此需要注意的是SMA的表型也不能完全由SMN2基因的拷貝數(shù)來推斷(圖1)。

二、脊肌萎縮癥的分類及臨床表現(xiàn)

根據(jù)患者的發(fā)病年齡和疾病的嚴(yán)重程度，脊肌萎縮癥分為5種亞型：①0型患者：一般多見于胎兒或新生兒，胎兒表現(xiàn)為胎動(dòng)減少，新生兒表現(xiàn)為肌肉反射消失、面部癱瘓、房間隔缺損和關(guān)節(jié)攣縮，最嚴(yán)重的表現(xiàn)為呼吸衰竭，病兒預(yù)期壽命大大縮短，大多數(shù)生存期在6個(gè)月以內(nèi)[5]；②1型患者：即嬰兒型，也稱為Werdnig-Hoffman病，患者出生后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)肌張力低下，頭部控制不佳和肌腱反射減弱或消失。嚴(yán)重的肌張力低下，表現(xiàn)為躺倒時(shí)的“蛙腿”姿勢(shì)，缺乏頭部控制，不能端坐，肋間肌肉薄弱，膈肌相對(duì)較小，患者往往出現(xiàn)吞咽功能減弱，由于呼吸肌無力，SMA患兒通常在2歲前出現(xiàn)呼吸衰竭[6]；③2型患者：即中間型，一般在出生后6～18個(gè)月內(nèi)發(fā)病，患者可以在發(fā)育過程中的某一階段獨(dú)坐，但無法獨(dú)立行走。該類患者多出現(xiàn)脊柱側(cè)凸、關(guān)節(jié)攣縮和下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直等并發(fā)癥，脊柱側(cè)凸和肋間肌無力往往導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部疾病。這些兒童的認(rèn)知能力是正常的[7]；④3型患者：即少年型，也稱為Kugelberg-Welander病，患者一般在出生后18個(gè)月～5歲內(nèi)發(fā)病，在輔助物支撐的幫助下可行走。與2型SMA 不同的是，這些人大多沒有脊柱側(cè)彎和呼吸肌無力等并發(fā)癥，這個(gè)群體的認(rèn)知和預(yù)期壽命一般不受疾病的影響[8]；⑤4型患者：在少年之后發(fā)病的歸分類為4型SMA，它們大約占SMA患者總數(shù)的5%，僅有輕微的癥狀。與3型相似，但是發(fā)病在成年期，通常認(rèn)為在30歲或更晚時(shí)候發(fā)病[9]。

圖1 SMN1基因與SMN2基因pre-mRNA的剪接

三、脊肌萎縮癥的治療

從SMA的首次報(bào)道至今已經(jīng)有100多年的歷史。在20世紀(jì)90年代之前，因?yàn)闆]有明確的分子靶標(biāo)，SMA的臨床試驗(yàn)相對(duì)較少，所進(jìn)行的研究通常涉及用于改善疾病癥狀的藥物，相關(guān)研究在以肌無力為特征的其他疾病如肌萎縮側(cè)索硬化癥或肌營養(yǎng)不良癥中表現(xiàn)出令人鼓舞的結(jié)果。SMA的遺傳和分子基礎(chǔ)的闡明為基于增加SMN蛋白表達(dá)以治療SMA的策略提供了理論基礎(chǔ)。這些策略包括利用低分子藥物或反義核苷酸藥物增加SMN2表達(dá)(導(dǎo)致更多全長SMN mRNA)，以及病毒載體介導(dǎo)的替代全長SMN1的基因療法。目前有些藥物已經(jīng)上市，有的藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，基于重組相關(guān)病毒載體的基因治療藥物已初露端倪。

1.低分子藥物：目前，全球正在開發(fā)多種通過不同機(jī)制增加全長SMN蛋白水平的低分子藥物。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿┍交∷徕c、丙戊酸和羥基尿等可以增加SMN2 mRNA水平，并且在SMA小鼠模型和細(xì)胞系中顯示出良好的結(jié)果，但是臨床試驗(yàn)顯示很少或沒有療效。其他低分子藥物如氨基糖苷類，主要通過抑制SMN2基因SMNΔ7外顯子8的終止密碼子的識(shí)別，而將截短的SMN蛋白質(zhì)延長，顯著增加SMN蛋白在SMA患者成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，皮下注射該化合物(TC007)后，雖然沒有延長小鼠生存期，但增強(qiáng)了SMA轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)功能[10]。除此之外，還在開發(fā)一類更有效的能夠改變SMN2轉(zhuǎn)錄物剪接模式的藥物，使得更有利于包含外顯子7， 這些藥物在SMA小鼠模型上具有非常顯著的功效，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。RG7800是美國PTC Therapeutics公司使用高通量藥物篩選平臺(tái)篩選到的一種低分子藥物[11]。羅氏公司對(duì)該化合物進(jìn)行了化學(xué)優(yōu)化，并將其作為口服生物藥物進(jìn)入臨床，2015年開展了1期多中心隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照研究，以研究成人和兒童SMA患者對(duì)RG7800治療12周后的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。在招募第1批患者后，由于在臨床前毒理學(xué)研究中觀察到影響眼睛的安全性問題，研究人員終止了臨床試驗(yàn)。最近，羅氏公司開展了兩項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，旨在研究化合物RG7916對(duì)1型、2型和3型SMA患者的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和療效，這兩項(xiàng)研究目前正在進(jìn)行。諾華公司正在尋求一種類似的策略，該策略也能夠增加SMN2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中外顯子7的保留，并且能夠顯著提高SMA小鼠模型的預(yù)期壽命[12]。2015年4月在4個(gè)歐洲國家啟動(dòng)了1型SMA患者Ⅰ/Ⅱ期口服LMI070(NCT02268552)臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)周圍神經(jīng)、脊髓、睪丸和腎臟血管具有不良反應(yīng)，在2016年中期，決定暫停招募患者，并將其作為平行的慢性臨床前毒理學(xué)研究，此試驗(yàn)自宣布以來，所有參加試驗(yàn)的患者都得到密切監(jiān)測(cè)，研究還在進(jìn)行，但不再招募患者。

2.反義寡核苷酸藥物：通過改變SMN2剪接方式，使更多外顯子7包含到最終的mRNA轉(zhuǎn)錄物中，并且增加全長SMN蛋白的表達(dá)是治療SMA的一種有希望的策略。這種策略的原理是通過設(shè)計(jì)一種能靶向SMN2前體mRNA的內(nèi)含子或外顯子中順式作用序列的藥物，從而通過影響各種反式剪接因子來調(diào)節(jié)SMN2前體mRNA的剪接。

反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)是治療性RNA分子，通過靶向結(jié)合內(nèi)含子或外顯子內(nèi)的互補(bǔ)序列，從而增強(qiáng)或破壞剪接事件。最初的ASO通過與外顯子8的3′端剪接位點(diǎn)結(jié)合而增加SMN2 mRNA中外顯子7的保留。隨后又鑒定了多個(gè)剪接調(diào)控位點(diǎn)，其中一個(gè)重要剪接調(diào)節(jié)位點(diǎn)位于SMN2基因內(nèi)含子7中，稱為ISS-N1，還有內(nèi)含子7內(nèi)的ISS-N2，內(nèi)含子6中的Element 1和與ISS-N1部分重疊的GC富集序列[13, 14]。 研究證實(shí)，在成纖維細(xì)胞中，ASO誘導(dǎo)的ISS-N1阻斷可明顯增強(qiáng)細(xì)胞中SMN2外顯子7的包含，并使得細(xì)胞內(nèi)SMN蛋白質(zhì)增加，同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ASO可高效增加SMN2外顯子7的包含和小鼠全長SMN蛋白質(zhì)表達(dá)水平[15]。但是全身給藥后發(fā)現(xiàn)ASO未能穿透小鼠血-腦脊液屏障，研究者通過腦室內(nèi)直接注射的辦法克服了這一障礙，使得小鼠脊髓中的全長SMN mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平增加。

目前已有多個(gè)處于臨床前研究階段的基于ASO的SMA療法。如嗎啉基反義寡核苷酸，可靶向內(nèi)含子阻遏物Element1進(jìn)而提高SMA小鼠的存活率[16]。Lorson等設(shè)計(jì)了一個(gè)雙功能RNA，此雙功能RNA含有一個(gè)針對(duì)內(nèi)含子7 /外顯子8連接點(diǎn)的ASO和另外一個(gè)可以募集hnRNP-A1的序列，hnRNP-A1是阻止外顯子8包含的剪接因子，研究證實(shí)這種雙功能RNA分子和其他雙功能RNA的腦室內(nèi)注射同樣能夠提高腦中全長SMN蛋白質(zhì)水平[17]。反式剪接RNA(trans-splicing RNA，tsRNA)是基于寡核苷酸的另一個(gè)策略， SMA治療性tsRNA是一種合成的RNA分子，可以與內(nèi)源性SMN2前體mRNA相互作用，導(dǎo)致雜交mRNA內(nèi)源性突變，從而產(chǎn)生更多全長SMN mRNA和蛋白質(zhì)。目前tsRNA在SMA小鼠模型也已成功應(yīng)用[18]。

在眾多ASO中，最值得一提的就是Nusinersen即Spinraza，Spinraza是一種2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)修飾的反義寡核苷酸，最初由IONIS Pharmaceuticals公司開發(fā)，設(shè)計(jì)用于結(jié)合SMN2前體mRNA內(nèi)含子7中的內(nèi)含子剪接沉默子，使負(fù)性剪接因子hnRNP A1/A2被置換且不能與SMN2前體mRNA結(jié)合，從而產(chǎn)生全長mRNA和完整的功能蛋白[19]，臨床前試驗(yàn)的成功促使IONIS Pharmaceuticals與Biogen聯(lián)合開發(fā)這種藥物用于治療SMA。經(jīng)過3個(gè)階段的臨床試驗(yàn)，全面評(píng)估了SMA患者鞘內(nèi)注射的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)和臨床效果[20, 21]。基于3個(gè)階段試驗(yàn)的積極數(shù)據(jù)，2016年12月，美國FDA批準(zhǔn)SPINRAZATM(Nusinersen)作為迄今為止第1個(gè)也是唯一一種用于SMA的遺傳治療藥物。

3.基因治療：SMA作為一種單基因疾病，基因治療有望徹底治愈SMA。病毒載體介導(dǎo)的SMN基因轉(zhuǎn)移在臨床前研究中已經(jīng)非常成功。Foust等利用自身互補(bǔ)腺相關(guān)病毒血清型9(scAAV9)作為載體成功拯救了SMA小鼠，這是SMA基因治療發(fā)展的一個(gè)里程碑[22]。本研究中，SMA小鼠出生后第1天，靜脈內(nèi)注射攜帶SMN1基因的scAAV9，分析發(fā)現(xiàn)有60%的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)SMN1蛋白質(zhì)，且完全改善了肌肉的運(yùn)動(dòng)功能和強(qiáng)度，治療后的小鼠壽命>400天，而未治療組小鼠壽命僅有16天。目前，這種方法已被其他多個(gè)研究組所重復(fù)[23]。但是，值得注意的是這種方法有嚴(yán)格的治療窗口期，隨著年齡的增長，治療效果迅速下降，出生后第5天注射只有部分效果，而在出生后第10天注射幾乎沒有效果，意味著設(shè)計(jì)基于SMN增強(qiáng)表達(dá)的療法，無論是通過基因治療方法還是其他方式，疾病早期診斷非常關(guān)鍵，在臨床癥狀出現(xiàn)之前要早診斷早治療。這一觀察結(jié)果同時(shí)提示，在個(gè)體發(fā)育過程中可能存在關(guān)鍵時(shí)期，其間足夠的SMN蛋白質(zhì)對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育是必需的。

AveXis Inc. 基因治療公司正在美國進(jìn)行一項(xiàng)臨床研究，這是第1個(gè)評(píng)估靜脈輸送scAAV9-SMN1至1型SMA患者的安全性的Ⅰ期臨床試驗(yàn)[24]。這項(xiàng)研究總共有15例SMA嬰兒參與進(jìn)來; 參與者分成兩組，其中3例患者接受低劑量(6.7×1013vg/kg)治療，12例接受高劑量(2.0×1014vg/kg)治療。截至2017年8月7日，所有15例患者在20個(gè)月大時(shí)仍然存活并無安全事件發(fā)生，而歷史隊(duì)列中存活率僅為8%。 在高劑量組，基因治療后進(jìn)行費(fèi)城兒童醫(yī)院神經(jīng)肌肉障礙測(cè)試(Children′s Hospital of Philadelphia infant test of neuromuscular disorders，CHOP INTEND)記錄運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(范圍0～64，分?jǐn)?shù)越高表明功能越好)，1個(gè)月時(shí)增加了9.8個(gè)點(diǎn)，3個(gè)月時(shí)增加了15.4個(gè)點(diǎn)，與此相比， 歷史隊(duì)列CHOP INTEND評(píng)分逐漸降低。在接受高劑量治療的12例患者中，11例能夠端坐，9例可以翻身，11例能由口進(jìn)食并且說話，2例能夠獨(dú)立走路。2018年1月16日AveXis Inc. 公司又公布了針對(duì)SMN基因候選療法AVXS-101的擴(kuò)大臨床試驗(yàn)計(jì)劃。除正在開展的對(duì)1型患者的關(guān)鍵試驗(yàn)(STRIVE)和針對(duì)2型患者的1期試驗(yàn)(STRONG)外，公司計(jì)劃再啟動(dòng)3項(xiàng)試驗(yàn)，涵蓋新的SMA患者群體，針對(duì)AVXS-101進(jìn)行更加深入的評(píng)估。此外，該公司還宣布針對(duì)2型患者的1期試驗(yàn)已經(jīng)完成了首位患者的用藥。良好的臨床結(jié)果促使諾華公司于2018年4月宣布以87億美元的價(jià)格收購AveXis Inc. 公司，諾華將與AveXis的團(tuán)隊(duì)一起建設(shè)基因治療平臺(tái)，以推動(dòng)越來越多的治療領(lǐng)域的基因治療藥物。

4.其他治療藥物：(1)神經(jīng)保護(hù)性藥物:Olesoxime是一種低分子藥物，研究顯示出神經(jīng)保護(hù)及促進(jìn)神經(jīng)突觸生長的特性。體外研究表明，在營養(yǎng)因子剝奪試驗(yàn)中使用olesoxime可以提高神經(jīng)元細(xì)胞存活率。此外，在肌萎縮性側(cè)索硬化的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，與對(duì)照處理相比，用olezoxime處理小鼠可防止體重減輕及嚴(yán)重肌肉功能衰退，并且使得小鼠壽命增加10%。這種藥物已經(jīng)在2013年完成了第2階段隨機(jī)、多中心、雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)。在歐洲不同國家的23個(gè)地點(diǎn)招募了165例3～25歲的2型和3型SMA患者，進(jìn)行了為期2年的研究。結(jié)果表明，olesoxime能有效保持運(yùn)動(dòng)功能，并改善2年治療期間的總體健康狀況。目前正在進(jìn)行一項(xiàng)由Hoffmann-La Roche發(fā)起的開放性試驗(yàn)研究，該研究將評(píng)估患者接受olesoxime 治療后的安全性、耐受性和有效性預(yù)計(jì)將在2020年12月完成。(2)骨骼肌肌鈣蛋白激活藥物：肌節(jié)是骨骼肌的收縮單位，鈣離子(Ca2+)是信息傳遞過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)離子，肌鈣蛋白復(fù)合物中Ca2+與肌鈣蛋白C的結(jié)合使得原肌球蛋白運(yùn)動(dòng)、肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白相互作用和肌肉收縮，由于Ca2+釋放的水平與神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)的幅度以及肌收縮力呈正比，因此控制Ca2+的釋放成為治療SMA和其他骨骼肌肉相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。美國Cytokinetics Inc公司與英國安斯泰來公司合作開發(fā)了CK-2127107(CK-107)，這種藥物主要就是通過減緩骨骼肌纖維中肌鈣蛋白復(fù)合物釋放鈣的速率，從而改善SMA患者的肌肉功能和身體狀況。Ⅰ期臨床試驗(yàn)測(cè)試了CK-2127107藥物的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。目前該藥物正在進(jìn)行二期臨床研究，納入對(duì)象為青少年骨骼肌疲勞患者以及SMA 2型、3型和4型的成年患者，主要在美國和加拿大招募患者。(3)干細(xì)胞治療:一旦運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，可嘗試通過干細(xì)胞移植來恢復(fù)其功能，其目標(biāo)之一是通過遞送神經(jīng)保護(hù)劑來支持內(nèi)源性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，并且最理想的預(yù)期結(jié)果是部分恢復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞。通過鞘內(nèi)注射脊髓前角來源的神經(jīng)干細(xì)胞至SMA小鼠，遷移到實(shí)質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生了一小部分運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，治療小鼠表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)能力和神經(jīng)肌肉功能的改善，而且預(yù)期壽命增加38%。盡管神經(jīng)干細(xì)胞移植在小鼠中獲得了良好的結(jié)果，其在人類疾病中的作用尚不清楚。目前在動(dòng)物模型中也嘗試了其他替代方案，其中包括使用胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行移植，這些細(xì)胞具有在體外和體內(nèi)分化成神經(jīng)干細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的能力，但是該策略應(yīng)用于人的SMA治療還為時(shí)尚早。

四、展 望

SMA作為導(dǎo)致嬰兒死亡的最主要遺傳病，在其致病基因發(fā)現(xiàn)21年后，第1個(gè)用于治療SMA的藥物SPINRAZATM最終成功上市，雖然這對(duì)于患者及家屬都是一大好消息，但是SPINRAZATM仍然不能最終治愈SMA。目前SMA治療的研究領(lǐng)域正在迅速擴(kuò)展，上述治療方案以及最近完成的AVXS-101一期臨床試驗(yàn)的結(jié)果令人非常鼓舞，但仍有幾個(gè)問題尚未解決。一個(gè)問題是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育是否存在缺陷，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能是否進(jìn)行性喪失，或者兩者兼有。所有這些方法的最佳干預(yù)時(shí)間在人類中并不清楚，特別是在這種情況下，是否存在不可逆轉(zhuǎn)的病理變化，事實(shí)上，盡管在SMA小鼠模型的幾項(xiàng)研究中確定了治療時(shí)間和療效之間的精確關(guān)系，但在人類中是否也是如此目前還不能確定。另外這些療法的臨床效應(yīng)是否會(huì)持續(xù)下去也不清楚，特別是在成長的兒童中。此外，動(dòng)物模型和有限的患者病例報(bào)告提供的證據(jù)表明，SMA病理改變不僅限于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，還涉及骨骼肌、神經(jīng)肌肉接頭和中間神經(jīng)元等，由于SMA最嚴(yán)重后果是全身器官功能障礙或結(jié)構(gòu)改變，目前尚不能確定靶向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元而不是全身組織的治療是否會(huì)隨著時(shí)間的推移而導(dǎo)致多器官功能障礙的發(fā)生。